基因表达载体构建实验方法

基因表达载体构建实验目的

较为官方的解释为：使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。通过这种手段，我们就可以将众多的目的基因进行异源性的表达，因此能够快速并且大量的富集到对应的目的蛋白；此外，我们还能够以农杆菌为目的基因的载体，通过植物侵染的方式，将目的基因转入到植物中，从而形成特殊的遗传材料，进行特定的课题研究。

基因表达载体构建实验原理

通俗点来理解，就是我们将一个感兴趣的基因，通过一种手段将其放到一个表达载体上，这个表达载体一般为细菌细胞内特有的一种环状双链DNA分子，称为质粒。将目标基因连接到质粒上之后，得到的就是一个人为拼接后的重组质粒，我们称之为表达载体。接下来我们就可以通过转化的方法，将这个重组质粒转化到感受态细菌中，例如trans5α，DH5α，DB3101等等菌株中。将转化成功的细菌克隆进行培养繁殖，得到的菌液就可以进行长时间冷冻保存了。待需要使用时，只需要将菌种从-80℃取出，进行复苏并培养，然后进行质粒提取，就可以再次拿到大量的目的基因表达载体，供后续实验使用。

基因表达载体构建实验步骤

设计引物，PCR扩增目的基因片段，切胶回收

目的基因加A，体系：

10 X easy buffer        1ul

dATP                       0.8 ul

Taq 酶                     0.1ul

回收产物                  8ul

72℃ 40min

XcmI 酶切 En-ccdB （50ul）

En-ccdB 质粒（200ng/ul）    50ul (1ug)

10X NE buffer                       50ul

H2O                                    38ul

XcmI 酶                               2ul       10U

37℃ 1h , 65℃ 20min热失活，跑胶回收（约2600bp）

加A后的产物 与酶切的pEntry-T 连接摩尔比1:1~5:1（10ul体系）

加A的回收产物    ul

酶切后的En-T      ul

5XT4 buffer        1ul

T4 ligase          0.5 ul

H2O              补齐

22℃ 1h

转化DH5α,涂LB固体培养基（kana），筛选阳性克隆后进行测序验证碱基序列。

自此一个基因表达载体正式构建完成，可以根据需要进行后续的进一步研究实验了。