要做KO的回复实验，该怎么设计方案？

首先，需要做回复实验的KO细胞，其建立不建议稳转gRNA+移码的策略，这是由于Cas9持续表达，gRNA又是作用于外显子上的体系，回复的时候移码突变必须要做cDNA的突变，也就是同义突变，将CRISPR识别的PAM序列去掉，否则cDNA也会被切割掉。另外，片段敲除则是2条gRNA在内含子上切割，在cDNA上没有识别切割位点，所以再进行过表达的回复实验就相对比较顺利。