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免疫组化（IHC），此种高端大气上档的实验自然深得科研者的宠爱。然而做过该实验的人都知道，IHC看似容易，但是其花样百出的问题总是让实验汪们的精神备受摧残，苦不堪言。
其实，若真的想把IHC做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验的。那么本文就对免疫组化进行抽丝剥茧的剖析，帮助大家更好的进行研究。
IHC反应实验流程
Answer: 冰冻切片取材可分为两种情况动物灌流固定和直接取材，石蜡切片是使用10%福尔马林溶液固定。
动物灌流固定：如小鼠心脏灌流，首先采用预冷的1×PBS灌流冲洗直至血液全部放出，随后灌注4%PFA直至小鼠僵直，而后解剖获取组织，于4℃、4%PFA中固定1h左右，1×PBS洗5次（30min/次），25%蔗糖溶液脱水12h左右包埋即可。
直接取材：直接选择新鲜组织进行冰冻切片，此时不需要进行抗原修复。缺点：切出的片子含水量会比较多，形成冰晶影响结果，而且后期的丙酮固定也会改变细胞的形态。
石蜡切片取材：动物组织取材（灌流与否都可以，并不影响后续的操作）后，置于10%福尔马林溶液中固定3-4天后，脱水，包埋，即可进行石蜡切片操作。
1. 冰冻切片较厚（8-12μm），操作简单，抗原活性好，但是保存时间短，且一定放在-80℃的低温冰箱中。2. 石蜡切片制备过程较复杂，抗原活性差，但切片薄（3-5μm），便于观察细胞的细微结构，且常温保存即可，非常方便。
Answer:
1. 一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对低；而多克隆抗体特异性弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可通过封闭来避免）。
2. 抗体的比例可依据抗体说明书或western blot的抗体比例来做即可。
3. 对于组织样本，一般要在37℃孵育1-2h 或4℃冰箱孵育过夜（效果最佳，且拿出后需37℃复温45min），并保持湿盒里的湿度来防止抗体蒸发。对于难以着色的，在第二天还需将湿盒置于室温孵育。
Answer: 封闭血清一般是和二抗同一来源，可封闭非特异性结合位点，降低背景噪音。也可使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗的来源一致。
Answer: 可选择一张阳性的片子，用计时器精确计时在显微镜下判断出具体时间后，再对所有片子进行显色，采用相同的时间来界定。一般如果抗体浓度适宜，操作无误，10分钟内肯定能够显色，如果超过该时间，说明一抗比例不够或者封闭太久等等原因。显色时间越短，则说明抗体浓度高或抗体孵育时间过长，需下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。
Answer: 苏木素复染时间一般为5min左右，可调整，染色时间太浅，可延长时间，反之缩短时间；随后进行盐酸酒精分化，数秒即可，自来水洗，最后置于氨水中返蓝。
1. 对照组必设。如阴性、阳性及自身对照。
由表中可知，只有6、7实验结果有意义。1-5均因对照组的结果已否定抗体的特异性或因ICH技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，则必须重复实验或换用抗体。2. 阳性着色细胞计数法。在 40 倍光镜下，随机选择不重叠的 10 个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组 3-6 张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。3. 灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用 image j 进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。4. 分级法。免疫组化的半定量一般分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察5-10个HPF。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值<1.0者为（+），1.0-1.5者为(++), >1.5者为(+++)。1. 把要做的切片先分好，做几个抗体可分几盒，不正常组织与正常组织要分开。其余做预实验用。2. 选择实验要做的抗体时，要结合他们的正常组织和癌组织的分别表达率。3. 试剂盒的选择可结合生物素强弱的情况。如：肝组织生物素含量高，S-P试剂盒生物素含量也高，故不能配合使用。4. 每次开始做时，都必须先清点实验的必需品是否齐全。想好可能发生的意外，并先想好补救措施。当抗体不够用的情况下，原先买的抗体最好不要用完，留做可能需要的验证试验。新的抗体要尽量同公司，同批号。5. 烤片（单一或综合）程度要适情况而定，可中途拿出甩一甩，尽可能先放在烤箱里烤3小时以上。切勿把片烤得太久了。程度刚好，脱蜡效果才会好。注意做好不同条件的切片标记。注意温度稳定，再烤片。6. 二甲苯脱蜡。温度过低时，可先把二甲苯整罐放进烤箱加热，或者可把片放在二甲苯里一起加热脱蜡，这样效果会更好；若温度适宜，那还是在室温下脱蜡，要不可能会适得其反。时间也是适情况而定。7. 高压修复时，要注意稀释比例，修复液的种类（EDTA不可以重新进行利用，可能发生交叉作用），PH值等。高压锅内压力未降至正常时不可打开，压力正常后可多放会儿，能更好的利用余压，把握程度。若是多次修复，每次都需先把锅内热水倒掉，换冷水，保证条件的可重复性。8. 抗体反复冻融可使效价降低。抗体要防止污染。不可用塑料保存，塑料可吸附抗体。抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS（其他稀释液，注意PH值，PBS为偏中碱性）稀释的抗体最好要当天使用。稀释比例恰好为佳，注意前带和后带效应。9. 吹干封片时不能有泡泡。若是没封好，可进行二甲苯、酒精脱树胶，吹干再次封片，但镜下效果会明显变差。因而，若没必要，最好不要再次脱胶。DAB显色需用中性树胶封片，AEC（易溶于有机溶剂）需用水性胶封片。10. 刚封完的载玻片会移动，故切片还没干时，尽量不要碰到盖玻片，可避免树胶溢出，片的整体效果不好。其实，做科研的都知道免疫组化是个苦活，不仅时间长、步骤多，还要经常接触有毒致癌物质。但自从免疫学摘得2018年的诺奖后，免疫学实验就成为了SCI文章进阶高分期刊的武器，所以纵然实验辛苦，科研人也必须花费大量时间精力去掌握免疫学领域中最常见的实验技术，让自己以后的科研路好走一些。如今，为了大家的科研路保驾护航，解螺旋现赠送书籍《医学免疫学实验原理和技术》，可快速扫除大家实验中所遇到的种种困惑，让大家轻松掌握免疫学里的实验技能，彻底告别免疫学实验的折磨。本书共14章，基本涵盖了医学免疫学研究所需的实验原理和技术，包括免疫细胞分离、纯化、表型和功能检测；抗体制备、免疫沉淀技术、荧光免疫分析技术等现代常用检测技术；以及免疫疾病动物模型制备技术等，为研究者提供专业的免疫学研究方法。本书注重于免疫学研究原理和技术的创新性和实用性，侧重于介绍实验原理、具体操作步骤、可能难点和破解技巧，有助于读者快速和系统地掌握免疫学经典和先进技术，更好地在实践中应用。本书适用于基础医学、临床医学、公共卫生学、药学以及护理学的医学生，也适用于从事免疫学及相关研究的医生、科研工作者及临床检验、免疫生物治疗科等临床科室工作人员。如今免费送书在即，限量300本，你还不快快行动么？扫描下方海报中的二维码，即可免费领取此书哦！本次直播将在哔哩哔哩和微信视频号同步播出，同时也会在双平台进行直播抽奖。大家可以去微信视频号进行直播预约，更多直播精彩内容不要错过奥。
