【LorMe周刊】FERONIA介导ROS来限制根际微生物群中的假单胞菌
作者：田秘密，南京农业大学博士在读，主要研究植物激素代谢调控根际免疫。
周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍FERONIA受体激酶介导ROS调控根际菌群中的假单胞菌的相关机制，原文于2021年发表在《Nature Plants》上。
微生物群落结构的维持对动植物的健康至关重要。通过重新筛选影响根系免疫和激素串扰的拟南芥突变体，研究鉴定了FERONIA（FER）受体激酶突变体（fer-8），其根际菌群富含荧光假单胞菌。通过菌群移植实验发现，fer-8根际富集有益菌群。FER对根际假单胞菌的影响很大程度上与其免疫支架功能、在发育中的作用以及茉莉酸自身免疫无关。然而，其突变体（fer-8）降低了根系活性氧 （ROS）的基础水平，同时NADPH氧化酶的缺失使得根际假单胞菌丰度升高。FER配体RALF23肽的加入足以富集荧光假单胞菌。这项研究表明，FER介导ROS产生以调节根际微生物中有益的假单胞菌水平。
1、微生物群落与宿主健康及适应性极其相关。已有研究表明，植物可能通过调节少数有益类群的丰度而达到最大限度的适应生物胁迫与非生物胁迫。然而，植物通过控制有益菌群丰度的基因调节器和机制在很大程度上是未知的。
2、荧光假单胞菌的富集与抑病土壤的形成有关，植物可能具有特异性调节有益假单胞菌的机制。此外，一些拟南芥天然种质具有不同水平的根际假单胞菌，同时保持整体高度相似的微生物群落组成，这表明植物可能具有调控有益假单胞菌物种水平的遗传机制。
一、HSM13/FERONIA（FER）抑制根际假单胞菌生长
为了鉴定调节根际有益假单胞菌物种水平的植物基因，试验利用了16个激素介导的抑制MAMP触发免疫突变体。结果发现，与野生型相比，每克根际样品中荧光假单胞菌在hsm13根际富集达10倍以上（图1b，c），在天然土壤和无菌平板中发育迟缓（图1a）。测试植物形态变化是否影响根际假单胞菌水平发现，bri1-5和ark1-1突变体的根际荧光假单胞菌水平与野生型相似（图1c），表明发育缺陷不太可能成为hsm13中荧光假单胞菌富集的基础。进一步地，我们发现fer-4与hsm13突变体具有相似的高水平WS365-Luc，且fer-4突变体在其天然启动子（pFER:FER–GFP）下的表达完全恢复了植物的形态和根际荧光假单胞菌WS365生长到野生型水平（图1e，g）。总的来说，hsm13（以下简称fer-8）在FER中携带功能缺失突变，导致生长迟缓和根际假单胞菌过度生长。
图1 hsm13/FERONIA(FER)抑制根际假单胞菌生长
为了确定fer-8突变对整体根际微生物组组成的影响，在天然土壤微生物群存在的情况下种植fer-8和野生型植物（图1）并进行了基于（16S rRNA）的微生物组分析。不同土壤样品（土体土壤、野生型和fer-8）之间的微生物群落存在明显差异。与野生型相比，fer-8中一致观察到了不同的微生物组分（图2a）；fer-8微生物组的丰富度和香农多样性较低（图2c）。其中，只有假单胞菌存在富集现象（图2d），说明假单胞菌在fer-8中大量富集且无门水平失调。假单胞菌属包含有益微生物和植物病原体，fer-8是否特异富集有益的假单胞菌或致病假单胞菌是否也在根际富集（科学问题&假设猜想）。研究通过几种系统发育不同的假单胞菌（包括病原菌和共生菌），以及远缘细菌分离株，测试其是否在fer-8根际富集。结果发现，与野生型相比，fer-8根际的假单胞菌菌株（共生菌株CH267除外）富集了2-18倍（图2e），这说明fer-8突变能显著富集大多数假单胞菌。
图2 fer-8微生物组未发生生态失调
三、有益的fer-8微生物群落
在第一代根际样品中，fer-8中荧光假单胞菌相对于亲本明显富集（图3b、d）。在fer-8微生物组存在条件下，第二代植物表现显著的生长促进作用（图3a、c、e）。另外，结果还发现第一代植物根际荧光假单胞菌的丰度与第二代植物的生物量之间存在显着的正相关（图3f）。结果表明，FER的单个突变将土壤微生物组转变为促进下一代植物生长的微生物组。为了测试这些菌株是否会在土壤中引发病害，将致病性假单胞菌番茄DC3000和假单胞菌N2C3接种在天然土壤条件下的植物根际。结果发现，两菌均未引发病症。结果表明，在天然土壤群落存在的情况下，病原性假单胞菌的富集可能不会有效地引起发病，因此，根际假单胞菌的普遍富集可能不会带来病害的风险。
图3 fer-8微生物群落分析
四、fer-8中的假单胞菌富集的影响因素分析
对fer-8和亲本的地上部和根部进行转录分析发现，fer-8突变体地上部表现出对灰霉病的抗性增强以及茉莉酸响应基因的特异性表达（图4b）。结果表明，fer-8突变导致茉莉酸信号在地上部而不是在根中被激活。为了测试茉莉酸介导的地上部自身免疫是否影响fer-8中的根际假单胞菌定植。结果发现，coi1-16 fer-8（茉莉酸感缺乏）突变体抑制了fer-8的发育迟缓表型，表明fer-8中的发育迟缓表型是由地上部茉莉酸自身免疫引起的（图4c，d）。其次，coi1-16 fer-8保留了较高的假单胞菌水平，与fer-8无显着差异（图4e）。最后，相继测试了水杨酸感知缺陷型突变体（npr1-1）、生物合成突变体（sid2-1）和自身免疫突变体（snc1）中的根际假单胞菌水平。结果发现，npr1-1中根际荧光假单胞菌没有显著变化。以上研究结果表明，茉莉酸自身免疫和水杨酸—茉莉酸拮抗作用都不能完全解释fer-8突变体中根际假单胞菌定植的增加。
图4 fer-8与茉莉酸信号的相关分析
2、FER介导根系活性氧（ROS）以控制假单胞菌
以ROS敏感染料（H2DCFDA）染色根部，发现fer-8中的基础ROS水平与亲本相比显著降低（图5a，b）。重要的是，假单胞菌WCS365在fer-8和亲本中表现出根ROS水平的显著降低（图5a，b），表明抑制根表面基础ROS可能对假单胞菌在根际的适应性至关重要。探究改变根际活性氧水平是否会影响假单胞菌在根际的生长发现，rbohD和rbohF都显著提高了天然土壤中的根际荧光假单胞菌（图5c）。
FER与免疫受体相互作用，促进天然免疫受体复合物的形成，包括EF-TU受体（EFR）和鞭毛蛋白传感2（FLS2）及其共同受体油菜素类固醇不敏感1相关激酶1（BAK1）。研究发现，fls2、efr-1和bak1-5突变体在自然土壤中生长时，其根际荧光假单胞菌水平与野生型植物相似（图5d）；bak1-5 bak1-1双突变体不影响天然土壤中根际假单胞菌的水平，这表明FER与BAK1/BKKl的相互作用在很大程度上可用于调节根际假单胞菌的水平。为了测试FER是否通过NADPH氧化酶调节根际假单胞菌。结果发现，fer-8 ROP2OX显著减少了在fer-8根际观察到的荧光假单胞菌的数量（图5f），增加了根系ROS水平（图5g）；根际荧光假单胞菌水平与基础活性氧水平显著负相关。
图5 FER介导根活性氧(ROS)以控制假单胞菌
FER是许多RALF肽的受体，包括RALF23（负调节FER功能）。以RALF23及其相关肽处理植物，发现人工合成的RALF23处理（1 μM）使荧光假单胞菌WCS365在野生型中生长，fer-8根际中不生长（图6a）。我们还发现RALF23过表达系在天然土壤中的荧光假单胞菌水平明显高于野生型（图6b）。这表明RALF—FER信号是病原体攻击后假单胞菌增加的可能机制（图6c）。
图6 FER对RALF23的感知丰富了假单胞菌的定植
在这项研究中，FER受体激酶的丧失有力地丰富了根际中的假单胞菌。尽管有新的证据表明根系分泌物组成的变化会影响微生物组结构，但我们发现FER调节的基础ROS通过ROP2依赖性NADPH氧化酶活性产生是根际假单胞菌负调节所需的新机制。ROS爆发是植物先天免疫激活的关键步骤，但我们的发现表明，FER介导的根际假单胞菌调节依赖于基础ROS，而不是由MAMP感知和先天免疫受体触发的诱导性ROS。RALF-FER途径是病原体进化上保守的分子靶标，通过招募有益的假单胞菌来保护FER可能是植物在面对病原体攻击时招募有益菌群的方式之一。总的来说，这项工作表明植物可以使用单一的调节剂和简单的线性途径来丰富复杂的根际微生物组中的有益假单胞菌，并有可能指导农业中新的育种和微生物组工程实践。
论文信息
原名：FERONIA restricts Pseudomonas in the rhizosphere microbiome via regulation of reactive oxygen species
译名：FERONIA 通过调节活性氧来限制根际微生物群中的假单胞菌
期刊：Nature Plants
发表时间：2021.05
通讯作者：Cara H. Haney
通讯作者单位：加拿大不列颠哥伦比亚大学