肿瘤细胞培养中的关键问题及应对方法
近年来，细胞培养技术广泛应用于生命科学的细胞生物学、遗传学、生理学、生物化学与分子生物学、病理学、药理学和**学等多个领域；细胞培养是一个很复杂的过程，包括动物细胞培养和植物细胞培养；笔者以HepG-2肝癌细胞为例简要介绍肿瘤细胞的培养环境、培养方法和细胞污染的来源及类型，以及培养过程中容易出现的问题。
细胞体外培养技术(Cell Culture Technique) 是指从体内取出单个细胞或细胞群，通过模拟体内的生理环境，使之在体外生存、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法；近年发展起来的细胞杂交、核移植和DNA介导的基因转移以及基因图谱的建立，无不与细胞培养紧密结合；掌握细胞培养的技术要点、实验方法和条件，并探讨细胞培养的技术方法和注意事项，是细胞培养的关键内容。
1、细胞生长环境
细胞生长的佳pH 值为7.0～7.2，其可耐受的pH值范围为6.6～7.8，如果培养液的pH值小于6.6或大于7.8 时，则会抑制细胞的正常生长甚至引起死亡。细胞体外培养技术的关键是培养液的设计，培养液可以提供细胞体外生存所需要的pH值、渗透压、营养物质和相关的调节物质。恒温培养箱是细胞生长繁殖的重要场所，其内部温度应维持在37℃、CO2浓度5 %（根据培养细胞的不同而存在差别），以及100 %的饱和湿度；CO2既是细胞代谢的产物，也是细胞增殖所需成份，并可对培养液的PH值起到调节的作用。另外，在培养箱底部的水盘中放入饱和硫酸铜溶液可以起到抑制**生长的作用。
2、细胞复苏
从液氮中取细胞时佩戴棉手套，液氮温度可达-196℃，不做防护会对皮肤造成损伤。不同复苏方法细胞的存活率不同，我们在复苏HepG-2细胞时采用先40℃溶解后37℃恒温培养的方法，此法比传统的37℃水浴溶解后培养的方法细胞存活率高，在溶解过程中需要用镊子夹住冻存管不停地摇动，使冻存管内的细胞均匀受热融化；细胞冻存液中含有10％的二甲基亚砜（DMSO），是一种重要的渗透性细胞保护剂，其能够快速穿透细胞膜进入细胞内，降低冰点和延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少对细胞的损伤；常温下DMSO对细胞的毒副作用较大，如果复苏时间过长，会造成细胞的损伤，在1-2 min内使冻存液融化；解冻的细胞应先缓慢加入5倍体积含血清的培养液，然后1000转离心5min，弃上清，以去除细胞冻存液中DMSO对细胞活力的损害，再向冻存管中加入含血清的培养液，缓慢吹打混匀细胞，转入已经37℃预温的培养瓶中进一步培养。（注意用移液枪吹打细胞时应慢吸轻吹，因为刚刚复苏的细胞比较脆，容易破碎。）
3、细胞贴壁不均匀
在细胞培养过程中我们常见到细胞贴壁不均匀的现象，我们对比了两种操作方法细胞的贴壁情况，以直径为10cm的大培养皿为例，一种方法是收集细胞于离心管，加入适量的培养液（1-2mL），吹打混匀，移到培养皿，加入6-7mL培养液于培养皿中，再吹打混匀；另一种方法是收集细胞于离心管，加入8mL培养液，吹打混匀，再移到培养皿；通过比较我们发现种方法细胞铺的更均匀，聚集在一起的细胞很少；铺完细胞后不用走8字的方法混匀，此法细胞随液体晃动幅度太大，细胞很容易发生再次聚集的现象，从而导致细胞贴壁不均匀；我们采用轻微地小幅度晃动几下后放入培养箱。
4、细胞传代
HepG2肝癌细胞的生长方式是单层贴壁生长，细胞生命呈现周期性变化，主要分为三期：潜伏期、对数生长期和稳定期，在对数生长期细胞呈现密度抑制和接触抑制的特点。细胞在原代培养1~4周后，由于细胞生存空间不足和或密度过大，可引起营养枯竭，进而影响细胞的正常生长和繁殖，此时需要进行传代培养。有研究报道：1967年，Van Wezel提出了“微载体”培养系统，是将一种对细胞无毒、无害的特殊颗粒放到培养液中，这种颗粒被称为微载体，大量的微载体使细胞可以在其表面附着生长，大大增加细胞生长的面积，并获得良好的生长环境，便于获得高密度培养细胞；此种方法对实验条件的要求比较高，笔者所在实验室并未开展。
5、细胞消化
有研究者对EDTA、胰酶和EDTA+胰酶三种消化细胞的方法进行了比较研究，发现胰酶消化细胞的效果好。胰酶是一种蛋白酶，通过在特定部位降解蛋白，使细胞膜上和培养皿壁结合处蛋白降解，同时细胞在其自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力作用下恢复为球形，从而脱离培养皿。胰酶溶液在pH值为8.0、温度为37℃时其作用能力强，消化前要用PBS缓冲液洗细胞2次，目的是洗掉之前培养液中的血清，否则影响胰酶的消化效果；我们在实验中曾经发生过此类现象，导致贴壁的细胞很难被消化下来；在消化细胞时以胰酶刚好覆盖细胞表层为宜，将细胞放在培养箱中1-2min，消化过程中要随时在显微镜下观察细胞消化情况，如在镜下观察到50%~70%的细胞形状变成圆形并与培养皿脱离，则立刻向培养皿中加入含血清的培养液终止消化（胰酶与血清蛋白结合阻碍了其消化细胞的过程，从而达到终止消化的目的）；消化时间不宜过长，否则会导致细胞损伤，出现生长缓慢、形态不规则和状态不佳等现象。我们还采用另外一种消化方法：加入胰酶轻轻摇晃培养瓶，让胰酶充分与细胞表面接触，接触1 min左右，肉眼观察待瓶底发白迅速吸掉胰酶，轻拍瓶底这样细胞就会从瓶底脱落下来，此时加入培养液轻轻吹打，后将脱落的细胞转移至其它瓶内继续培养；此法不用离心，简化操作对细胞损伤小，初学者需要掌握消化时间后，才能达到更好的效果。
6、细胞冻存
我们采用DMSO和胎牛血清按1：9的比例配成冻存液。冻存液用前要无菌；准备冻存的细胞是无污染的、且处于对数生长期，加入细胞冻存液时要缓慢，防止出现渗透性休克。细胞冻存采用慢速冷冻的方法，在DMSO的作用下，可使细胞内的水分渗出细胞外，防止产生过多的冰晶损伤细胞。计算机程序性降温为较好的降温方法，如果条件不允许，可采用传统方法，4℃ 5~10min（如果冻存管可以用脱脂棉包裹则冻存效果更好），-20℃ 0.5~2 h，-80℃过夜，然后移入液氮冻存。
7、细胞污染来源
细胞污染来源很多，概括起来有两类，即外源性污染和内源性污染。
7.1 外源性污染：
7.1.1 操作环境的污染：细胞无菌操作室、超净台、培养箱、冰箱、水浴箱和显微镜载物台等长时间未清理或不符合无菌要求；培养箱中的水盘没有及时清洗、没有及时更换高压**的三蒸水、没有定期紫外照射**等；我们在实验过程中，发现将培养箱水盘中加入硫酸铜粉末制成饱和溶液，这样能够显著减少水盘的污染。
7.1.2 操作者本身：防护服**没达到标准或穿戴不规范，操作人员对细胞操作不规范或其本身带有病原体，在无菌室来回大幅度走动大声喧哗都会引起细胞污染；
7.1.3 实验器材和培养液的污染：实验器材清洗不干净、**不、长时间存放，枪头不及时更换均可造成二次污染，培养液过滤不，血清可带来支原体污染和病毒污染，未纯化的物质、试剂、水、血清和生长辅助因子等都可能成为污染的来源；培养液的配制应做到少量多次，即一次配制用几天的，用完再配，避免一次配制的量过大而长期使用，这样容易造成污染。
7.1.4 细胞之间的交叉污染：主要源于细胞培养室内细胞株种类较多，易导致细胞之间相互污染。
7.2 内源性污染：
细胞建株时的污染，主要是细胞的组织或器官本身带有病毒或支原体。
8、污染类型及识别
8.1 霉菌污染：培养液中可见到淡黄色或白色的漂浮物，镜下可以看见细胞之间有丝状或管状菌丝漂浮在培养液中，短期内培养液一般不变混浊。
8.2 **污染：**在普倒置显微镜下为黑色细沙状，培养液浑浊呈现黄色，对细胞生长有较大影响。
8.3 **污染：镜下有丝状物，看上去像死细胞碎片或珊瑚状，慢慢变成黑色丝状，培养液无明显变化。
8.4 支原体：黑色的，以不同的形状出现，一般培养液会变浑浊，支原体常见于牛血清中，而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染的细胞没有明显特征，后可导致细胞全部死亡。
8.5 我们在实验过程中也曾出现过黑胶虫，在高倍镜下能看见其有不规则的运动，有的在原地打转，有的像在蠕动，对处于对数生长期的肝癌细胞基本无影响。
结语
细胞培养技术作为一种日趋成熟的研究方法，无论在基础研究和应用研究方面都越来越受到生物技术界的重视，在基础医学、临床医学、预防医学和生物学等领域应用极为广泛，熟练掌握细胞培养的方法和条件，灵活使用并不断优化实验方法，了解并解决培养过程中可能出现的问题，终实现低成本、高密度细胞培养的目标，目前已经建立起应用于不同环境、实现不同目的细胞培养的装置，相信随着细胞培养技术的不断进步，在不久的将来会进入一个崭新的阶段。