编译：YQ，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
细菌是与动植物具有广泛共生关系的生物。同时细菌与真菌也存在共生关系，比如根瘤菌和小孢根霉的共生关系。小孢根霉是一种水稻病原菌以及土壤腐生菌，根瘤菌可产生一种抗有丝分裂毒素，协助真菌感染水稻幼苗。根瘤菌可从小孢根霉中分离培养，与大多数革兰氏阴性菌一样携带III型分泌系统（T3SS）入侵宿主。T3SS可将效应蛋白注入宿主细胞促进感染，然而根霉菌与小孢根霉共生的效应蛋白仍未被鉴定。根霉菌的基因组表明存在与黄单胞菌和劳尔氏菌同源的类转录激活（TAL）效应蛋白。TAL效应蛋白是一种T3SS分泌的特异性DNA结合蛋白，进入寄主细胞后作为转录因子调控靶基因表达。
TAL效应蛋白包括4个结构域：N端信号肽、N端或C端核定位信号、中心DNA识别域、C端激活域。DNA识别域包含高度保守的重复序列，每个重复序列含2个可变氨基酸，决定其DNA序列识别的特异性。目前，伯克氏菌的TAL效应蛋白广泛用于基因编辑，使其特异性结合DNA靶标。用于开发的TAL蛋白包括BurrH和Btl。与典型TAL效应蛋白相比，Btl蛋白缺乏信号肽、核定位信号和激活域。
TAL效应蛋白的同源鉴定为研究根瘤菌与真菌共生关系提供分子基础，并更好地理解TAL蛋白家族的功能多样性。本研究揭示Btl蛋白可改变宿主转录组，在共生关系中发挥作用。
原名：A TAL effector-like protein of an endofungal bacterium increases the stress tolerance and alters the transcriptome of the host译名：真菌内共生细菌的TAL效应物改变寄主转录组并增强寄主抗逆性期刊：PNAS（Proceedings of the National Academy of Sciences）通讯作者单位：康奈尔大学植物病理学与植物微生物学系DOI号：10.1073/pnas.2003857117① 菌株材料。小孢根霉在PDA培养基生长，根瘤菌在LB培养基生长，细菌与真菌在固体培养基上共生培养。② Btl基因分析。基于Btl19-13基因位点构建克隆载体，在根瘤菌中表达，与小孢根霉共培养，DAPI染色观察细胞形态。GFP荧光载体观察Btl在宿主的亚细胞定位，Southern blot鉴定Btl基因在根瘤菌的定位。电泳迁移率变动分析Btl蛋白的互作DNA序列。对感染转基因根瘤菌的小孢根霉进行生长测定。③ RNA-seq。提取小孢根霉总RNA，HISAT2将序列比对至参考基因组，DESeq2进行表达分析，基于差异表达基因的启动子区域进行结合原件预测。TAL效应蛋白包括4个结构域：N端信号肽、N端或C端核定位信号、中心DNA识别域、C端激活域（图1A）。本研究在公开的三个根瘤菌（Mycetohabitans rhizoxinica）的全基因组中鉴定Btl基因。菌株B13有19个重复序列及1段btl基因（本研究命名为btl19-13），菌株B1和B14有3段btl基因，因此不同菌株的TAL基因差异主要为拷贝数和重复序列，TAL基因通过点突变和重组嵌合产生差异是常见的变异现象，这种变异可改变其DNA结合位点。本研究将btl19-13+mCherry克隆载体导入小孢根霉，用共聚焦显微镜检测mCherry荧光，载体中还包含YFP荧光基因，使细菌能独立显示。结果表明真菌菌丝内mCherry和EYFP信号明显且一致（图1B），表明共生过程中在btl19-13在菌丝内表达。通过EffectiveT3对Btl19-13蛋白序列进行分析检测到信号肽存在于N端，上游的启动子片段发现了与黄单胞菌和劳尔氏菌同源的植物启动子诱导元件。为验证btl19-13的分泌功能，我们利用Btl19-13的转基因丁香假单胞菌注射烟草。Btl19-13基因与腺苷酸环化酶基因（Cya）融合，Cya将三磷酸腺苷转化为环磷酸腺苷，ELISA可检测到，因此作为效应蛋白进入宿主的报告基因。AvrPto效应蛋白作为阳性对照，T3SS突变株作为阴性对照。结果表明Btl19-13:Cya在寄主中表达，但在T3SS突变株中不表达（图1C），表明Btl19-13依赖T3SS系统而分泌，属于T3SS分泌蛋白。此外，Btl19-13 N端的45个氨基酸（信号肽）若突变，也会影响其在寄主内表达，表明其前45个氨基酸对分泌功能是必要的。Btl19-13的C端序列分析表明其不含核定位信号。然而有一个类似核定位信号的区域存在于所有Btl蛋白中。为评估Btl19-13的亚细胞定位，将其转化到GFP荧光表达载体中并导入酵母细胞表达。结果表明黄单胞菌的TAL效应子定位于细胞核，而eGFP:Btl19-13表达载体的细胞中看不到荧光，表明全长Btl19-13蛋白对酵母细胞具有毒性（图1D）。于是试验构建了一个N端截断的表达载体（Btl19-13Δ1-598），只包含DNA识别域和C端序列，结果表明eGFP: Btl19-13Δ1 – 598具有核定位信号。因此，Btl19-13蛋白在宿主细胞核中发挥功能。
图1 Btl19-13的基因结构、表达模式、分泌功能和核定位。A：Btl蛋白序列结构域，T3（分泌信号），NLS（核定位信号），RIRK（假定核定位信号），AD：激活域；B：Btl19-13在菌丝内表达；C：烟草中cAMP定量分析，以验证Btl19-13蛋白在寄主内的表达；D：表达GFP标记蛋白的酵母细胞的共聚焦显微镜，用核素染色定位细胞核。为研究Btl蛋白能否调控宿主基因转录，本研究利用农杆菌介导GUS报告基因在烟草内表达，其中包括携带Btl19-13结合元件（BE）和扰乱的结合元件（sBE）的Bs3基因（图2A）。电泳迁移率转移分析表明Btl19-13具有特异DNA结合能力，然而Btl19-13没有改变GUS活性，（图2B），也不具有转录抑制因子的功能（图2C）。在外源条件的实验验证了Btl19-13可能是小孢根霉的效应蛋白，但GUS报告基因结果表明Btl19-13缺少转录激活活性。因此本研究实施敲除Btl19-13基因，直接评估其对共生关系的影响。结果表明B13Δbtl19-13没有不同于野生型感染真菌的能力。在非生物胁迫试验中，过氧化氢用于氧化胁迫，氯化钠用于渗透胁迫，十二烷基硫酸钠（SDS）用于细胞膜胁迫。结果表明感染突变株的小孢根霉在SDS胁迫下生长缓慢（图3A-B），而btl19-13质粒转化（pBtl19-13）使得表型恢复。为探究Btl19-13对小孢根霉细胞膜耐受性的作用机制，本研究对感染突变根瘤菌的小孢根霉进行RNA-seq。结果表明有15个基因差异表达（图3C），其中14个基因的启动子具有Btl19-13结合元件。
图2 Btl19-13对烟草叶片GUS瞬时表达的影响。A：GUS表达载体示意图，包括典型效应子AvrBs3结合元件，Btl19-13结合元件；B：植物GUS活性的荧光测定，dT19-13（与Btl19-13具有相似序列的TAL效应蛋白）；C：多个效应蛋白的相互作用。
图3 Btl19-13对小孢根霉细胞膜抗逆性和基因表达的影响。A-B：十二烷基硫酸钠（SDS）的细胞膜胁迫测定；C：差异表达基因韦恩图。鉴于Btl19-13基因增强了宿主对细胞膜胁迫的耐受性，但是否所有菌株都具有具有相同功能有待确定。菌株B1、B3和B14的Btl基因编码不同的DNA结合序列，表明它们靶向的结合元件存在差异。本研究对不同环境的小孢根霉的共生根瘤菌的Btl基因进行Southern blot定位（图4A），以Btl19-13作为探针。B1、B13和B14菌株检测到的条带数量和大小与基因组序列预测相匹配（图4B），每个菌株都至少产生了一条强杂交条带。有几个条带在菌株中是常见，但没有两个菌株具有完全相同的条带模式，这表明虽然Btl基因在菌株中广泛分布，但其基因随环境而变异。因此，Btl蛋白可能在功能上产生分化，通过验证Btl18-14基因的表达无法恢复B13Δbtl19-13突变体细胞膜耐受性的表型证明了这一点（图4C-D）。
图4 不同菌株中Btl基因的多样性。A：根瘤菌株地理位置；B：btl19-13为探针的Southern blots；C-D：btl19-13突变株中表达pBtl18-14的影响。Btl19-13的分泌功能、核定位、改变宿主转录组及增强宿主细胞膜耐受性的结论，表明Btl蛋白在根瘤-根霉共生中其重要的效应子作用。与黄单胞菌和劳尔氏菌相比，Btl蛋白显示C端核定位信号和N端分泌信号的退化，这与内共生菌易积累有害突变有一定关系。Btl蛋白的中心重复序列退化，但仍能特异性地结合DNA，因此在进化上受过强烈的选择作用。虽然数据显示Btl19-13改变了宿主转录组，但其机制尚不清楚，因为GUS报告基因检测中未能检测到Btl19-13对转录的影响，这可能与C端核定位信号的缺失有关系。先前研究表明Btl蛋白具有转录抑制作用，但本研究没有发现Btl19-13对dT19-13的抑制作用，因此其转录激活/抑制性质有待研究。考虑到内共生菌与宿主的共同进化，Btl蛋白可能通过与特定根霉菌（植物中不存在）的协同效应子互作而发挥功能。RNA-seq发现差异表达基因的启动子具有Btl19-13的结合位点，是未来确定Btl蛋白如何改变宿主转录的重要步骤。Btl19-13增加根霉菌的细胞膜耐受性的机制同样不清楚，可能与感染过程中根霉脂质代谢的主要变化有关。对真菌脂质代谢的重表达有助于细菌营养需求及细菌入侵。Btl19-13引起的差异表达基因中不存在脂代谢基因，但部分差异基因影响脂代谢途径。未来代谢组或脂组分析可以揭示Btl19-13引起的变化。在其他真菌中，对SDS的耐受不仅与脂质代谢有关，还与真菌毒力和氨基酸代谢有关。因此Btl19-13在共生关系中发挥有益作用。虽然根瘤菌的Btl基因大小显著减少，但在不同的菌株总仍保守存在，表明Btl蛋白对共生关系重要作用。而Btl蛋白可能出现功能性分化，因为不同基因组拷贝数不同，且DNA结合域序列产生变异，不同基因间也无法产生互补表型。不同菌株的Btl蛋白可能针对功能不同的宿主基因，也可能针对功能相关的不同基因。Btl蛋白可能影响特定细菌和真菌之间的共生，根据宿主基因型的不同，Btl蛋白可能对共生关系的持久性产生不同的影响。因此，Btl基因的多样性及与宿主基因组学的关联将是未来研究方向，本研究重点分析一个TAL效应蛋白Btl19-13，表明它在结构上存在缺失，但具有T3SS系统分泌性和核定位功能。Btl19-13的表达改变了宿主转录组，并提高了宿主细胞膜耐受性，且其功能与其他Btl蛋白并不完全相同。因此本研究揭示了一个Btl效应蛋白的功能独特性，且在共生关系中发挥重要作用。
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