科研 | 国人作品：盲肠灌注丙酸盐对瘘管猪肝脏代谢组和转录组特征的影响
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论文ID
原名：Hepatic Metabolomic and Transcriptomic Responses Induced by CecalInfusion of Sodium Propionate in a Fistula Pig Model
译名：盲肠灌注丙酸盐对瘘管猪肝脏代谢组和转录组特征的影响
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：3.571
发表时间：2019.11
通讯作者：朱伟云
通讯作者单位：江苏省消化道营养与动物健康重点实验室；动物消化道营养国际联合研究中心；南京农业大学消化道微生物研究室；
DOI号：10.1021/acs.jafc.9b05070
实验设计
实验动物
从一商业化农场中购入16头杜长大阉公猪（8周龄，月16 kg），安置于单独设置的围栏中并保证自由采食（商品化全价料）。预饲3天后，在盲肠做瘘管手术。同时，在猪颈静脉安装静脉插管以采集血液样本。试验期为28 天，试验组灌注丙酸盐 ( 2 mol/L，25mL，pH 5.8 ) ，对照灌注等量生盐水（pH 5.8），每天灌注两次（7：00和18:00）。
样品收集
在试验的第28天将所有猪屠宰，从颈静脉采集血液样品并离心（3000 g，4℃，15min）以收集血清，将样品置于-20℃下储存。切除肝脏组织，用磷酸盐缓冲液冲洗后立即放于液氮中冷冻，用于进一步分析。
生化指标分析与激素测定
使用比色法在AU2700自动分析仪上进行各项生化指标的测量，主要包括甘油三酯（TG）、总胆固醇（T-CHO）、总胆汁酸（TBA）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、谷丙转氨酶（ALT / GPT）和谷草转氨酶（AST / GOT）。使用商品化的酶联免疫吸附测定试剂盒测量血液中的胰岛素和肠道激素（胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、酪酪肽（PYY）、胆囊收缩素（CCK）和胃饥饿素（Ghrelin））的水平。
短链脂肪酸的测定
以1：2（w/ v）的比例在肝脏样品中加入相应体积0.9％的生理盐水进行匀浆。将肝脏匀浆置于3000 g条件下离心15 min，取上清液。取200 μL肝脏上清液或血清，按照1：1 的比例加入5％（w / v）的磺基水杨酸-巴豆酸溶液，混匀后置于-20℃下保存过夜。然后，将混合物在12000 g条件下离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，上机测定。
代谢组学分析
使用气相色谱质谱联用技术对肝脏样本中的代谢轮廓信息进行采集。使用SIMCA-P+13.0软件进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。将VIP值>1.0和P值<0.05的化合物视为差异代谢物。使用MetaboAnalyst 4.0软件进行代谢通路分析和代谢物富集分析。
RNA 提取和转录组学分析
使用RNA TRIZOL 提取试剂盒提取肝脏的总 RNA，用带有 Oligo的磁珠富集 mRNA。然后，将得到的mRNA打成片段，再以片断后的mRNA为模板合成 cDNA。纯化后，经末端修复、添加碱基A和，加测序接头再经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina HiSeq 2000进行测序。
将处理后的测序读长序列与猪参考基因组(Sscrofa10.2)序列和参考基因序列比对，找出差异表达基因。使用 FPKM方法计算基因表达水平；使用DESseq方法鉴定不同组之间的差异表达基因。将倍数变化≥1.5 且 q 值＜0.05设为阈值。分别使用DAVID生物信息学资源和 KEGG 数据库进行GO富集分析和通路富集分析。
实时荧光定量 PCR
使用RNA TRIZOL 提取试剂盒提取肝脏的总RNA，使用市售的cDNA逆转录试剂盒将 RNA 反转录为 cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒，在Step One PlusTM实时荧光定量 PCR 系统进行qPCR测定。使用2-ΔΔCt方法进行数据计算。引物序列见表1。
表1实时荧光定量 PCR 所用引物序列
结果
生化参数和激素分泌
为了阐明丙酸盐灌注对猪宿主代谢的影响，本研究测定了血清和肝脏样品的各项生化指标。结果表明，丙酸盐灌注显著降低了血清中甘油三酯的水平（P <0.05）（见表2）。其他与脂质相关的参数，包括总胆固醇、总胆汁酸、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白，在试验组和对照组之间无显著差异(P > 0.05)。丙酸盐灌注并未影响肝功能参数（谷丙转氨酶和谷草转氨酶）。此外，丙酸盐也并未影响肝脏中炎性细胞因子（IL-1β、NF-κB、TNF-α和透明质酸酶）的水平。有趣的是，丙酸盐灌注显著降低了肝脏中甘油三酯的水平，这与血清中的结果一致 (P < 0.05)。肝脏中总胆固醇、总胆汁酸、谷丙转氨酶和谷草转氨酶的浓度在试验组和对照组之间并无显著差异（图 1）。
在实验进行的第14 天，餐后灌注丙酸盐后，采集不同时间点的血液样本以测定胰高血糖素样肽-1、酪酪肽、胆囊收缩素和胃饥饿素的水平。测定结果显示，试验组和对照组中的胰高血糖素样肽-1、胆囊收缩素、胃饥饿素和胰岛素水平并无显著差异 (P > 0.05)（图 2）。实验组中餐后0 min的酪酪肽水平显着高于对照组（P <0.05）（图2B），这可能是由于在第14天前灌注了丙酸盐。
血清和肝脏中短链脂肪酸的含量
盲肠灌注丙酸盐显著增加了结肠内容物中丙酸的浓度(P < 0.05)。短链脂肪酸的变化会进一步导致甘油三酯的水平发生改变，为评估丙酸盐对血清和肝脏中短链脂肪酸含量的影响，本研究采用气相色谱技术对血清和肝脏中的短链脂肪酸的含量进行了测定。结果显示，试验组和对照组血清中的短链脂肪酸含量（包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸）并没有显著差异(P > 0.05)（图 3A）。除试验组中异丁酸含量较高以外，肝脏中其他的短链脂肪酸并没有受到丙酸盐灌注的影响（图 3B）。
肝脏代谢轮廓分析
为探明丙酸盐灌注引起的代谢变化，本研究采用气相色谱质谱联用技术进行了肝脏的代谢轮廓分析。经正交偏最小二乘判别分析，共鉴定出 90 种差异代谢物（图 4）。丙酸盐灌注导致 12 种代谢物水平发生显著改变 (VIP > 1 和 P < 0.05)（表3）。其中，氨基酸代谢通路中的天冬氨酸和丝氨酸以及三羧酸循环过程中的苹果酸、6-磷酸果糖、琥珀酸和天冬氨酸水平显著升高，脂代谢过程中的硬脂酸和2-磷酸甘油酯水平显著降低。有几种长链脂肪酸水平发生显著下降，主要包括花生四烯酸、二十二碳六烯酸和十六烷酸，而试验组中甘油水平有增加的趋势。
随后，研究者对代谢物进行了富集分析（图5）。富集分析结果显示，在试验组中，受到影响的通路主要涉及苹果酸-天冬氨酸穿梭、线粒体电子传递链以及柠檬酸循环，且谷氨酸代谢、精氨酸代谢和脯氨酸代谢也有涉及。果糖和甘露糖的降解以及糖异生过程同样受到了丙酸盐灌注的影响。
肝脏转录组分析
为揭示丙酸盐灌注影响的分子过程，使用RNA序列考察了肝脏的基因表达谱。设定倍数变化≥1.5和q<0.05的过滤条件，使用DEGSeq对差异表达基因（DEG）进行筛选。从试验组中的18062个基因中鉴定出356个差异表达基因（134个上调和222个下调）（图6）。如表4所示，在试验组中，与脂肪酸合成有关的基因SCD1、FABP3、ACSL5和FASN均出现下调，与脂质代谢过程相关基因LIPG、CPT1A、ADIPOR2、LPGAT1和SLC16A1均出现上调。此外，经丙酸盐灌注后，糖异生关键基因PCK1出现上调，而与糖酵解相关的基因HKDC1、GCK和G6PC均出现下调。
利用GO数据库对差异表达基因进行功能分析，解析差异表达基因主要参与的生物学过程。GO分析结果显示，有 33 个显著富集的 GO term，主要包括三羧酸循环、蛋白质和氨基酸代谢以及脂质代谢和葡萄糖代谢等（图7）。富集的与三羧酸循环相关的 GO term主要包括羧酸代谢过程、一元羧酸代谢过程及羧酸分解代谢过程。富集的与蛋白质与氨基酸代谢相关的 Go term主要包括细胞氨基酸生物合成过程、α-氨基酸代谢过程、氨基酸甜菜碱代谢过程以及与蛋白质和氨基酸代谢相关的蛋白激活级联反应。丙酸灌注处理导致与脂代谢相关的长链脂肪酸代谢过程、脂代谢过程、胆固醇生物合成过程以及脂肪酸代谢过程的响应增强。富集的与葡萄糖代谢相关的 GO term主要包括己糖生物合成过程、单糖生物合成过程和糖异生过程。
当把差异表达基因映射到 KEGG 代谢通路上时发现，丙酸盐灌注显著富集了10条代谢通路（图 8）。富集程度最高的代谢通路主要包括氧化磷酸化、糖酵解/糖异生过程以及过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路。同时，还富集到了包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢在内的氨基酸代谢过程。此外，丙酸盐灌注还影响了与脂代谢相关的脂肪酸代谢和脂肪细胞因子信号传导通路。值得关注的是，这与GO 分析的结果一致，均涉及氨基酸、葡萄糖和脂代谢过程。
通过qPCR对测序结果进行验证
为对RNA-seq测定的基因表达谱进行验证，本研究选择了六个基因（SCD1、FABP3、CPT1A、PCK1、GCK和LIPG）进行实时qPCR分析（图9）。虽然测试的6 个基因的表达趋势相似，但经两种方法获得的倍数变化值在某些情况下是不同的，这一结果证实了RNA测序数据的可靠性。
图 9 qPCR对测序数据的验证结果
讨论
本研究评估了盲肠灌注丙酸盐对猪肝脏代谢组和转录组特征的影响。结果显示，丙酸盐降低了血清和肝脏中甘油三酯的水平，并增加了血清酪酪肽的分泌，并未导致血清和肝脏中除异丁酸以外的其他短链脂肪酸发生变化。肝脏代谢组学分析显示，丙酸盐灌注导致 12 种代谢物发生显著变化，其中与氨基酸代谢相关的天冬氨酸和丝氨酸以及三羧酸循环过程中的苹果酸、6-磷酸果糖和琥珀酸水平显著升高，而与脂代谢相关的硬脂酸和2-磷酸甘油酯水平显著降低。肝脏转录组分析结果也表明丙酸盐灌注能够影响氨基酸、葡萄糖和脂代谢过程。
甘油三酯和胆固醇水平是评估脂质合成的重要参数。盲肠灌注丙酸盐导致猪血清和肝脏中的甘油三酯水平发生变化。先前的研究显示，乙酸能够降低小鼠体内的脂质积累并改善肝脏功能。有研究者评估了膳食补充乙酸盐和丙酸盐对肥胖和肝脏脂质代谢的影响，发现用含高浓度乙酸盐和丙酸盐的高脂饮食对C3H / HeOuJ小鼠干预22周后，小鼠肝脏中甘油三酯的浓度出现下降。然而，这与本研究结果相反，短期或长期丙酸盐或乙酸盐干预并未影响血清中甘油三酯的水平。此外，丙酸盐能够降低小鼠和人血清的胆固醇水平。但本研究结果显示，盲肠灌注丙酸盐并没有影响猪血清和肝脏中胆固醇的水平。
补充丙酸盐和乙酸盐能够降低肝脏中ω6:ω3长链脂肪酸的比例，而丙酸盐能够直接增加HepG2细胞中奇数链脂肪酸的形成。本研究借助于气相色谱质谱联用技术评估了盲肠灌注丙酸盐后肝脏代谢轮廓的变化，结果显示丙酸盐灌注显著降低了硬脂酸(C18:0)和2-磷酸甘油酯水平。此外，花生四烯酸(C20:4, ω6)、二十二碳六烯酸(C22:6, ω3)和十六烷酸(C16:0)水平也出现显著降低。这表明，丙酸盐能够降低肝脏中长链脂肪酸的合成，这也与丙酸盐灌注后血清和肝脏中甘油三酯水平降低这一事实相符。
短链脂肪酸能够被肠道上皮细胞吸收并提供能量，也可从血液转运至肝脏，从而直接影响肝脏的代谢。在作者之前的研究中，盲肠灌注丙酸钠显著增加了结肠内容物中丙酸的浓度。更重要的是，丙酸盐灌注显著增加了结肠的长度，这表明丙酸盐在结肠中被吸收了并作为能量来源提供能量。同时，试验组结肠中的丁酸浓度降低，这表明过量的丙酸替代了丁酸作为能量来源进行供能。与结肠中短链脂肪酸的浓度变化相比，除异丁酸外，血清和肝脏中短链脂肪酸的水平在屠宰时并未出现显著变化。由于盲肠无法进行连续灌注（每天两次），所以研究者无法捕捉到这些变化。据报道，异丁酸浓度的增加与小鼠的胰岛素抵抗和瘦素血症有关。除直接影响肝的代谢外，丙酸盐还可以作为信号分子来激活其受体FFAR2和FFAR3，从而刺激酪酪肽的分泌。在本研究中，丙酸盐的非连续灌注仅影响餐后0 min的血清酪酪肽水平，并未影响实验期间猪的体重变化。
为揭示丙酸盐诱导甘油三酯降低的分子作用机制，本研究开展了肝脏的转录组学分析。结果显示，丙酸盐灌注富集的与脂质相关的代谢通路主要包括过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路和脂肪酸代谢通路。在这些通路中，肉毒碱棕榈酰基转移酶1A （CPT1A）、脂联素受体 2（ADIPOR2）和内皮脂肪酶（LIPG）基因出现上调。CPT1A通过在外模中将长链酯酰辅酶A转化为长链酰基肉碱，将长链脂肪酸转移至线粒体中以进行脂肪酸β氧化过程。ADIPOR2主要在肝脏中表达，其过表达会增加脂肪酸β氧化。LIPG是甘油三酯脂肪酶家族的一员，甘油三酯脂肪酶在高代谢率和血管化的组织中（如肝脏、肺、肾和甲状腺）血管内皮细胞中合成的，可以水解高密度脂蛋白磷脂酰胆碱中的sn-1和 sn-2位脂肪酸。然而，肝脏中其他重要的肝脂肪酶并未受到丙酸盐灌注的影响。综上所述，CPT1、ADIPOR2和LIPG表达增强表明，丙酸盐可促进肝脏中的脂肪酸β-氧化和三酰甘油降解过程。
丙酸盐灌注导致与脂肪酸合成相关的基因，包括SCD1、ABP3、ACSL5 和FASN，均出现下调，SCD可以催化饱和脂肪酸的去饱和作用，靶向破坏小鼠的SCD1可显著降低组织中甘油三酯的含量。FABP3可以结合长链脂肪酸并运输脂质以满足甘油三酯和磷的脂生物合成。ACSL5的过表达可促进脂肪酸中甘油二酯和甘油三酯的合成，而ACSL5的敲除则减少甘油三酯的合成。脂肪酸合酶（FASN）是一种催化脂肪酸从头合成的酶。 SCD1、FABP3、ACSL5和FASN的表达缺失表明甘油三酯和脂肪酸的合成均减少，这与丙酸盐灌注引起的甘油三酯的降低是一致的。丙酸盐通过调节肝脏中与脂质代谢相关基因的表达，激活了脂质代谢并抑制了脂肪酸合成过程，从而降低了甘油三酯的水平。
除了脂质代谢外，丙酸盐还调节了葡萄糖代谢。高脂饮食喂养的小鼠膳食中补充丙酸盐可改善葡萄糖耐量，并激活回肠中的游离脂肪酸受体 2（FFAR2）以降低大鼠肝脏中的葡萄糖生成。已有研究发现，丙酸盐能够通过肠脑神经回路激活与肠道糖异生有关的基因。在本研究中，丙酸盐灌注并未影响血清中葡萄糖的水平。我们发现丙酸盐灌注富集到了糖异生和糖酵解通路。在这些代谢通路中，PCK1 出现上调，而HKDC1、GCK和G6PC3出现下调。PCK1 是肝脏中重要的关键的糖异生酶。HKDC1和GCK编码己糖激酶家族的蛋白质，该蛋白会使葡萄糖发生磷酸化以产生6-磷酸葡萄糖，而G6PC会刺激葡萄糖6-磷酸酶的产生。 PCK1水平升高表明糖异生过程加快，HKDCC1和GCK水平下降，从而导致糖酵解减少。丙酸盐通过加快肝脏糖异生和抑制糖酵解过程来调节葡萄糖代谢。
总之，本研究证明了丙酸盐可通过抑制猪体内脂肪酸合成过程和促进脂质代谢过程以降低脂质代谢。此外，丙酸盐可促进糖异生并抑制糖酵解过程。这些发现强调了丙酸盐对宿主代谢存在有益作用。
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