科研 | Cell Rep.：微生物源性线粒体辅酶对宿主能量和卵子发生的系统调节
编译：Y.too，编辑：Tracy、江舜尧。
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实验设计
1.采用子去绒毛去除肠道微生物群研究肠道细菌影响卵巢中的卵母细胞发育情况；
2. 采用线粒体膜电位的TMRE指标对mito-EYFP果蝇卵巢进行染色确定肠道细菌的清除是否影响宿主线粒体的活性；
3. 采用线粒体复合物I的化学抑制剂对肠道菌群完好的果蝇线粒体功能进行抑制，探讨线粒体活性的降低是否能抑制GF雌果蝇卵子发生；
实验结果
1. 去除肠道微生物群下调卵巢线粒体基因
为了研究肠道细菌如何影响卵巢中的卵母细胞发育，我们通过卵子去绒毛去除肠道微生物群，并在无菌条件下将这些GF雌性果蝇置于标准饮食中。如Elgart等人所证明的，与常规饲养(对照)雌性果蝇相比，GF雌性果蝇卵巢中晚期卵母细胞的数量较低(图1A-1C)，但补充本实验室分离的一株醋酸杆菌属Acetobacter spp.，Col1可使其完全恢复。为了探讨GF雌性果蝇卵子发生减少是否与宿主线粒体的变化有关，我们首先通过测定16S线粒体DNA来分析线粒体含量，羽化后第6天对全卵巢的分析显示，与对照组相比，GF果蝇的线粒体DNA水平较低(图1D)；在卵巢成熟前的第2天，卵子发生和线粒体DNA含量都有较小的下降(图S1A、S1C)。我们对mito-EYFP雌性果蝇保育细胞、卵泡细胞和成熟卵母细胞线粒体含量进行分段特异性分析，发现GF与对照组仅有轻度差异(图1E)，暗示GF果蝇卵巢线粒体DNA水平较低主要是由于后期卵母细胞数量减少所致。
为了检验肠道细菌的清除是否影响线粒体基因的表达，我们选择了一个具有代表性的线粒体转录组(线粒体编码和核编码)，分析了它们在GF和对照中的水平。大多数线粒体基因在第2天和第6天GF雌性卵巢中表达下调(图1F和S1D )，但在GF雌性成熟卵母细胞中不表达(图1G)，而对肠道和头部组织的分析显示它们只有轻度的减少(图1G)，暗示细菌清除对线粒体基因表达的影响在发育中的卵室中最为明显。与抑制卵子发生的可逆性(图1B和1C)非常相似，通过补充一株醋酸杆菌分离株Col1的细菌，卵巢线粒体基因的下调被完全逆转(图1E)。
图1 与对照组相比，无菌(GF)雌性卵巢(Ovs)线粒体功能降低
(A)以下6天yw雌性的卵巢DAPI染色的代表性图像:常规饲养(Ctrl)、GF和醋酸杆菌分离株的单菌落(Col1)单菌关联(GF + bac)。(B和C)卵巢中11-14个卵泡的数量(B)和11-14与9-10阶段的比例(C)。(D)全卵巢线粒体DNA含量的变化倍数(FC)，通过肌动蛋白DNA归一化后的线粒体16S (mt16S)的DNA编码进行qPCR分析。(E) FP荧光强度在6、8期卵泡和哺育细胞中以及在Ctrl和GF mito-EYFP雌性成熟卵母细胞中的FC。(F)全卵巢线粒体编码基因(ND1、COI、CytB和ATP酶)和核编码线粒体基因(Milt、mtSSB、Tim8、PMI、ND-SGDH和ND-20)的mRNA FC (log2)与(A)病例的Ctrl相比。(G)线粒体基因的mRNA FC (log2)。(H)第6天雌性mito-EYFP卵巢tre染色的代表性图像。(I)各卵泡室卵泡细胞tre与YFP强度的比值(至第8期)。(J)在(A)的病例中，用qLC-MS测定单独卵巢ATP和ADP的FC。(K) ATP和ADP与Ctrl(左右)相比整体水平的变化倍数和ATP/ADP比值的分布。(L)第(A)项中雌性平均体重(mg)。
2.GF雌性果蝇中线粒体功能和ATP产生减少
为了确定肠道细菌的清除是否也影响宿主线粒体的活性，我们用线粒体膜电位的TMRE指标对mito-EYFP蝇卵巢进行染色，我们采用TMRE / YFP比值作为与线粒体含量无关的线粒体功能的内在度量。解剖卵巢的分期特异性分析显示，与对照组相比，GF雌性卵腔周围的体细胞卵泡细胞TMRE / YFP水平降低(图1H和1I)。线粒体膜电位的这种降低在不同的状态下（从胚芽到第8期卵室）都有观察到，但在第6 ~ 8期最为显著。作为线粒体输出的独立评估，我们采用定量液相色谱-质谱(qLC-MS )测定ATP和ADP水平，第6天GF雌性果蝇全卵巢ATP和ADP水平均显著低于对照组(图1J)，而在雌性GF果蝇的全身样本中也观察到明显较低的ATP和ADP(以及GTP和GDP)水平(图1K和S2A)，包括经总质量归一化后(图S2B)。我们在成熟卵母细胞和切割的GF雌性果蝇头部中观察到ATP的较小减少(图S2C)，这些变化与雌性GF果蝇相对于对照组的总体重轻微下降相一致(图1L)，表明细菌去除对宿主ATP产生的系统性影响。另外，与对照组相比，GF雄性果蝇的ATP和ADP水平显著降低(图S2D)，GF雄性果蝇的体重也小幅下降(图S2E)。总之，这些发现为细菌清除的两个主要影响提供了证据：宿主的生殖器官和非生殖器官产生ATP的全体性减少，以及发育中的卵泡细胞中线粒体活性的大量衰减。
图2 通过对线粒体的整体或卵泡细胞特异性抑制来抑制卵子发生
(A)鱼藤酮浓度下Col1 (肠道醋菌分离)的细菌密度(OD)。(B)分析以常规方式饲养的雌性(yw)在第11-14阶段及第9-10阶段的卵室数目。(C)线粒体基因的mRNA FC，基于6天未处理(Ctrl)和鱼藤酮暴露(Rot) OrR雌性卵巢的qPCR分析。(D)鱼藤酮处理组和未处理组卵巢线粒体基因的mRNA FC (y轴)与GF和常规饲养的雌性果蝇的各自FC (x轴)绘制。(E和F) 6天鱼藤酮处理(Rot)和未处理mito-EYFP的雌性(Ctrl)第6期8卵室的TMRE/EYFP卵泡细胞的代表性图像(E)和各自的TMRE/EYFP比值。(G)与(D)所示阶段卵泡细胞中平均TMRE/EYFP FC相同。(H)未经处理(Ctrl)和鱼藤酮处理(Rot)的雌性卵巢ATP和ADP FC。(Ⅰ) tj > siND-20和tj > siND- SGDH卵巢ND-20和ND- SGDH mRNA FC与tj > siCtrl雌虫比较。(J) TMRE染色的6天tj > siCtrl、tj > siND - 20和tj > siND -SGDH雌果蝇卵巢(红色)代表图像。(K)第6期8个卵腔卵泡细胞内的TMRE FC，与(J)的情况相对应。( L ) tj >siCtrl、tj > siND-20和tj > siND- SGDH雌性卵巢11-14和9-10期卵室数(左)及其比值(右)。
3. 体细胞卵泡细胞线粒体功能的减少足以抑制卵子发生
为探讨线粒体活性的降低是否能抑制GF雌性果蝇卵子发生，我们对肠道菌群完好的苍蝇线粒体功能进行抑制，并分析其对卵子发生的影响。我们首先考察了线粒体复合物I的化学抑制剂鱼藤酮的暴露对肠道菌群的影响，为了避免肠道菌群的明显破坏，我们确定了仍然允许细菌生长的鱼藤酮浓度(图2A )。25 μM鱼藤酮暴露3天对细菌几乎没有影响，但足以抑制卵子发生，表现为11 ~ 14阶段卵母细胞数量显著减少(图2B和S3A )。将鱼藤酮转移至无鱼藤酮饮食3天，可使卵子发生完全恢复(类似于在GF雌性果蝇饮食中补充肠道细菌来拯救卵子发生)。对鱼藤酮处理GF雌果蝇与对照的整个卵巢的分析显示，线粒体转录本的变化特征，其与GF雌性果蝇与对照的基因特异性变化高度相关(图2C和2D )，而用罗替酮处理能够模拟细菌去除对卵泡细胞线粒体功能的(阶段特异性)影响(图2E-2G )以及对ATP和ADP水平的影响(图2F对图1J )。
由于鱼藤酮是通过食物系统提供的，暴露于鱼藤酮的雌卵子发生的抑制可以通过直接和/或间接机制来介导，因此，我们试图确定体细胞卵泡细胞线粒体功能的组织特异性缺失是否足以抑制卵子发生。我们使用traffic jam-GAL4(Tj)表达针对线粒体复合物I的ND-20和SGDH亚基的RNAi，特别是在体细胞卵泡细胞(Tj)中。我们对Tj> siND-20和Tj> siSGDH与Tj> siCtrlRNAi株系的ND-20和SGDH水平进行qPCR分析，结果发现敲减效率为40% - 50%(图2I)，这两个基因的卵泡特异性敲除足以抑制线粒体膜电位(图2J和2K)，并在阶段11-14和阶段9-10中显著减少卵腔的数量和比例(图2L)。相比之下，生殖系统特异性RNAi虽然获得了类似的敲减水平(使用NOS> siND-20和NOS> siSGDH) (图S3B与图2I)，但对卵发生的影响微不足道(图S3C)。
4. RbF增加了GF雌性果蝇的卵子发生和线粒体功能
在无卵雌性果蝇中，营养缺乏的结果和抑制卵发生的结果之间的相似之处可以通过添加足够的膳食酵母来逆转，这表明去除细菌会导致抑制卵发生的营养缺乏。GF果蝇较低的线粒体功能和ATP水平让我们怀疑线粒体辅酶的缺乏，这种辅酶不是由宿主合成的，但可以从细菌代谢产物中得到。我们发现了一个有前景的维生素B2 (RbF)，它是两种必需线粒体辅酶FAD和FMN的前体。因此，我们研究了饲粮中添加RbF对GF雌性果蝇线粒体功能和卵子发生的影响，饲粮中添加RbF提高了第11 ~ 14阶段GF雌性果蝇的卵室数量和比例(图3A ~ 3C)。TMRE/EYFP的组织特异性分析进一步揭示了GF雌性果蝇卵泡发育过程中卵泡细胞线粒体膜电位的完全恢复(图3D和3E)，这还伴随着部分但仍然重要的GF雌性果蝇卵巢和全身ATP水平的恢复(图3F和3G)。总之，这些发现揭示了在通过细菌提供辅酶前体来调节卵子发生的系统机制中，辅酶前体是线粒体功能所必需的。
图3 核黄素(RbF)增加GF雌性果蝇卵泡细胞的卵发生和线粒体功能
(A)常规饲养(Ctrl)和GF OrR雌性(第6天)的DAPI染色卵巢的代表性图像，添加和不添加RbF (GF+RbF和GF)。(B和C)第11阶段卵巢内14个卵腔的数目(B)和第11-14阶段与9-10期的比率(C)。(D和E) mito-EYFP雌性第6天TMRE /EYFP染色卵巢的代表性图像(D)和第6期和第8期卵泡细胞TMRE /EYFP比值(E)。(F)与对照组相比，添加和不添加RbF (GF+RbF和GF)的GF雌性卵巢ATP和ADP FC (log2)。(G) 雌性全身ATP和ADP及其比值(ATP/ADP)与(F)相同。
5. 代谢组学分析显示GF雌性果蝇中氧化磷酸化的整体减少
接下来，我们试图研究细菌去除对宿主线粒体功能和ATP产生的作用如何影响宿主的代谢状态。为了分析细菌对多种代谢物的影响，我们在第6天与对照雌性果蝇相比，使用靶向LCMS分析了GF雌性果蝇全身和卵巢中的197种极性代谢物和151种脂质。
倍数变化的全局聚类和主成分分析(PCA)显示，通过在饲粮中添加天然肠道细菌，GF雌性动物的新陈代谢发生了逆转(图S4和S5)。对细菌提供的维生素和各自的线粒体辅酶的更集中分析显示，与对照组相比，GF雌性果蝇全身和卵巢的RbF和FAD水平显著降低(图4A和4B)。GF雌性果蝇全身样本中4- pyridoicacid(维生素B6衍生物)和生物素(B7)的水平也较低，而GF雌性果蝇的卵巢中检测到的所有B型维生素均缺乏，包括焦磷酸硫胺素(B1衍生物)、烟酸(B3)和泛酸盐(B5)(图S6A)。由于FAD对于很多代谢物的酶解(或化学修饰)是必需的，我们评估了细菌去除对FAD依赖和不依赖于FAD的不同代谢物亚群的影响。尽管几乎所有的FAD依赖代谢物在雌性GF果蝇体内都高于对照组，但FAD独立代谢物没有首选的变化方向(图4C)。通过对雌性GF果蝇与对照组差异代谢物的途径富集分析，我们进一步发现了能量产生主要途径(图4D和S6B)的代谢物显著减少，包括柠檬酸循环(TCA)、糖酵解、戊糖磷酸和电子传递链，而这些变化也与参与能量转移的核苷酸整体水平较低一致，如ATP、GTP、CTP和UTP，但与相应的核苷、腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷不一致(图S2B和S6C)。除丙酮酸、琥珀酸和a-酮戊二酸被FDA依赖酶降解的代谢产物(图4E和4F)外，GF雌性果蝇全身和卵巢的TCA、糖酵解和戊糖磷酸代谢产物水平均显著降低(图4E和4F)。而对每个样本中代谢物水平作为雌性平均体重函数的分析显示，雌性体重与全身ATP和GTP水平之间几乎呈线性关系(图4G和S6D)。
基于代谢产物丰度分布的相似程度，我们进行了层次聚类分析，以显示所有检测到的培养上清代谢产物的全局概况(图3)，具有相似丰度模式的代谢产物被定位在更靠近的位置。除了这些影响能量生成途径外，肠道微生物的清除还增加了整个机体的氨基酸水平，但GF雌性果蝇卵巢的氨基酸水平没有增加(图4H)；与非必需氨基酸相比，必需氨基酸的增加更为显著(图4H和4I)。
脂质代谢产物分析显示，与对照组相比，GF雌性果蝇全身(而非卵巢)的脂质代谢产物水平普遍较高(图5A)。大多数脂肪酸(图5B)、甘油衍生物(图5C)超过54个碳的甘油三酯、16和18个碳的溶血磷脂酰胆碱(lysoPCs)和溶血磷脂酰乙醇胺(lysoPEs)含量较高(图5D)，这些溶菌体和溶菌体的增加伴随着它们各自的前体磷脂酰胆碱(PCs)和磷脂酰乙醇胺(PEs)的持续减少。
图4 GF雌性果蝇ATP生成所需代谢产物水平较低
(A)分别添加和不添加天然肠道细菌(GF+bac和GF)的常规饲养(Ctrl)和普通饲养(GF)雌性第6天全身(whole body，Wb)中RbF的相对水平。(B) Wb和卵巢中的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)水平与(A)相同。(C) FDA依赖酶(左)和FDA不依赖酶(右)降解(或修饰)的极性代谢产物的平均FCs (log2)。(D)估计的可能性表明，代谢产物水平的降低是偶然观察到的(在Wb、GF和GF+bac与对照雌性的卵巢中)。(E)三羧酸循环、糖酵解和戊糖磷酸途径代谢产物代谢图。(F) (E)代谢产物的FC (log2)。(G) (A)中ATP的Wb水平与雌性体重的关系。(H)必需氨基酸(左)和非必需氨基酸(右)的FC，用液相色谱-质谱(LC-MS)测定Wb(上图)和卵巢(下图)。(I)关键的FCs (Ess.aa)和非必需氨基酸(NE.aa)在GF+bac和GF雌性果蝇的Wb中(两者都比Ctrl)。
图5 GF雌性果蝇Wb中脂质水平升高
(A)不同脂质间连接的代谢图，显示GF与常规饲养(Ctrl) 雌性果蝇在第6天时Wb和卵巢发生显著变化(FDR<0.05)。(B)添加和不添加天然肠道菌群(GF+bac和GF)的6日龄GF雌性果蝇Wb和卵巢中特定脂肪酸的FCs。(C)在Wb和卵巢中甘油衍生物的FC (B)。(D)TAGs、PCs、PEs、lysoPCs和lysoPEs在Wb(顶部)和卵巢(底部)的平均折叠变化(log2)。
6. 饲粮中添加RbF可以抑制GF雌性果蝇氨基酸和脂类的增加
因为许多在GF雌性果蝇中较高的代谢物（如丙酮酸、α-酮戊二酸、甘油-3P氨基酸和脂肪酸）已知被FAD依赖性酶降解，它们在GF雌性果蝇中的增加可能是由于FAD缺乏引起的（图4B）。这些较高水平代谢物也可能增加相关代谢物的水平（例如TAG，甘油和DHA），这些是不能被FAD依赖性酶直接降解的相关代谢物（图5C和5D）。为了验证这一假设，我们用RbF（FMN/FAD前体）补充了GF雌性果蝇的饮食，并测试了其抵消FAD依赖性代谢物增加的能力。与此预期一致，RbF补充导致FMN/FAD依赖性酶降解（或化学修饰）的代谢物特异性减少（图6A，上图），这包括氨基酸，TCA代谢物和甘油衍生物的广泛减少（图6A，中图和下图）。结合降低的脂肪酸水平和TAG，溶血肽和溶血PC（图6B和6C），这些发现支持FAD缺乏对GF雌性果蝇全身这些代谢物水平升高的因果关系。
图6 外源RbF可以抑制GF雌性中FDA依赖性代谢产物的增加
(A)顶部:用LC-MS分析第6天雌性Wb中FDA依赖性(左)和非FDA依赖性极性代谢物(右)的平均FC (log2)。(B)各种脂类代谢产物的FC (log2)。每个点对应一组中链、长链和极长链脂肪酸(右上)，以及一组带有一定数量碳的TAGs、PCs、lysoPCs、PEs和lysope(左上、左下、右下)的平均变化。(C)去除细菌(红色)和添加RbF(黑色)对受FDA依赖酶降解(或潜在影响)的TCA、糖酵解和脂质代谢物的相反影响的指标(箭头)的代谢图。
7. 线粒体与Aldh的联系对卵子发生的影响
先前的研究表明，卵子发生还取决于醛脱氢酶（Aldh）的卵巢活性，我们发现其在GF雌性果蝇中较低。已知Aldh可以解毒线粒体中过氧化的活性醛产物。这提高了GF雌性果蝇卵巢中Aldh减少可能与这些雌性果蝇线粒体功能降低有关的可能性。为了评估这种可能性，我们研究了Aldh与线粒体功能之间的相互作用，我们从第3天到第6天暴露25 μM鱼藤酮对线粒体的抑制模拟了细菌去除对卵巢中Aldh表达的抑制作用（图S7A），用3 mM的Aldh抑制剂氰胺进行相互处理，显示了细菌去除对发育中的卵室中TMRE/EYFP比率的组织特异性影响（图S7B），并降低了卵巢中ATP和ADP的水平（图S7C）。这些结果表明，GF雌性果蝇中线粒体功能的降低导致卵巢Aldh的下调，而这又对卵巢中的线粒体功能和输出产生负面影响。
讨论
1. 细菌对线粒体功能的影响调节宿主能量和卵子发生
以往的研究表明，肠道细菌的丢失可以抑制卵子的发生和繁殖力，但从肠道到卵巢的影响机制仍然没有被阐明。我们的研究结果显示了肠道对卵巢的影响机制，即通过降低细菌来源的RbF和其他B族维生素的水平(这些B族维生素可能是线粒体功能所需但不是由宿主合成的)介导的机制。GF寄主中RbF水平的降低与RbF衍生物、FAD水平的降低、TCA代谢物全身水平的降低以及寄主中线粒体生成和ATP水平的总体降低一致，这些影响还伴随着卵巢卵泡细胞线粒体活性的明显减少和后期卵母细胞产量的减少，以及从而导致的生殖能量消耗减少。RbF的添加增加了机体和卵巢ATP水平，恢复了卵巢卵泡细胞的正常线粒体功能，增加了晚期卵母细胞的数量和比例。在常规饲养的果蝇中，我们通过鱼藤酮低剂量处理以及卵泡细胞中关键线粒体基因的组织特异性敲除，可以证明线粒体功能降低对卵子发生抑制的因果贡献；减少线粒体功能的结果在定性和定量上与去除肠道细菌的结果相当，例如，去除细菌和鱼藤酮处理在以下方面的显著相关性证明了这一点:(1)滤泡细胞线粒体膜电位的阶段性降低，(2)卵巢线粒体基因转录本的变化。这些结果表明，肠道细菌的清除降低了宿主的线粒体功能，而卵巢卵泡细胞线粒体活性的降低足以解释卵子发生的抑制。
GF雌性果蝇中线粒体功能和卵子发生的减少在很大程度上被RbF互补逆转，表明卵子发生依赖于线粒体功能普遍需要的细菌源性辅酶。作为FAD(和FMN)的系统来源，RbF可能分别介导对卵子发生的直接和间接影响，主要通过RbF对卵泡细胞线粒体功能的局部影响和对能量状态的生理反应的影响。在这两种情况下，细菌衍生的RbF对卵子发生的调节并不排除其他细菌因子潜在调节的可能性，而与单独补充RbF相比，通过细菌补充能实现更有效（更全面）的代谢恢复，其他可能影响宿主线粒体和生殖功能的细菌因子的主要候选物包括B族维生素：B1，硫胺素；B3，烟酸（NADH前体）；B5，泛酸；B6，吡哆醇；和B7，生物素。
2. 细菌对宿主氨基酸和脂质的影响
尽管大多数与能量生产有关的代谢产物在GF雌性中都较低，但我们发现了一些显著的例外，如α-酮戊二酸、琥珀酸和丙酮酸水平升高，由于这些代谢物被FAD依赖的酶降解，因此在GF雌性果蝇中它们的水平升高可能是由于FAD的缺乏造成的，而类似的原理可能适用于被FAD/FNM依赖酶降解的额外代谢物，也可能适用于受FAD/FNM依赖酶底物或产物变化间接影响的反应物。FAD缺乏的直接影响可能是导致全身氨基酸、嘌呤代谢产物、脂肪酸和甘油- 3P水平升高的原因，其中，甘油-3P和脂肪酸水平的升高可能会影响相关的代谢流，导致TAGs、lysoPC/PE、DHA和甘油的间接增加。这与报道的长链β-氧化功能丧失时TAGs和脂肪酸的增加以及敲除Srt4抑制线粒体功能后分解代谢受损的情况一致，而补充RbF对GF雌性果蝇中大多数代谢物升高的恢复影响进一步提供了详细的功能证据，表明这些代谢物水平的升高是由FAD的消耗引起的。
虽然FAD的缺乏可以为无GF雌性果蝇氨基酸水平的升高提供一个直接的机制，但它本身并不足以解释必需氨基酸(对比非必需氨基酸)的显著增加；然而，必需氨基酸的增加可能是氨基酸的总体均匀增加与无法减少必需氨基酸的合成两方面相结合导致的。在抑制ATP产生的GF条件下，雌性可能会从减少氨基酸的合成中获益，但这只可能发生在非必需氨基酸的合成上，因此，非必需氨基酸水平的降低可能是由于合成的补偿性减少，而这也仅限于这些氨基酸。
3. 细菌参与生长信号的统一机制
细菌对宿主线粒体功能和能量平衡的系统贡献可能为以往研究的不同发现提供解释。果蝇肠道细菌已被证明是通过调节胰岛素信号通路和TOR营养感应来增加氧气消耗和促进幼虫生长的；细菌非依赖性研究表明，ATP和其他线粒体因子参与葡萄糖代谢与胰岛素分泌的耦合。成年果蝇对葡萄糖的摄取刺激ATP的产生，进而促进胰岛素前体细胞(IPCs)分泌胰岛素样肽(dILPs)，而ATP的抑制被证明会抑制ILP的分泌，果蝇神经元中线粒体活性的解耦导致胰岛素信号的抑制。对果蝇的遗传分析进一步确定了果蝇TOR (dTOR)是胰岛素通路的下游效应体。有科研者在哺乳动物中也报道了胰岛素、TOR和线粒体功能之间的类似联系。根据目前研究的结果，我们提出了细菌对线粒体功能和ATP产生影响的统一机制，即解释了肠道细菌如何在不同物种中调节胰岛素和TOR通路，以及胰岛素和细菌如何调节繁殖能力。
4. 肠道细菌的系统和局部调节
先前已有研究表明，肠道细菌可以通过促进卵巢中的Aldh活性来支持卵子发生，但从肠道到卵巢的影响还没有被研究过。细菌-线粒体连接可以直接和/或间接填补该影响缺口，这些包括细菌衍生的B族维生素对体细胞卵泡细胞中线粒体活性的局部影响，体细胞卵泡细胞为发育中的卵母细胞提供必需的代谢物，以及可能需要基于信号传导的卵子发生抑制，以确保足够的ATP用于基本功能。这对于评估局部和整体细菌的相对贡献对卵子发生影响与细菌衍生维生素的多效性功能相混淆，例如，RbF对GF果蝇卵子发生的积极作用可能是由于RbF对卵巢卵泡细胞的局部影响或通过促进卵子发生的生理上调的信号传导途径引起的。这种联合的假设是合理的，并且在一定程度上得到以下发现的支持：外源RbF恢复了GF雌性卵泡细胞中的线粒体膜电位，但ATP水平仅部分恢复。
5.细菌-线粒体轴的保守性调节宿主能量和卵子发生
生物化学反应在能量生产中的高度保守性和对少数信号通路的依赖，暗示细菌-线粒体轴也调节哺乳动物宿主的生长和繁殖。在小鼠和人类身上的多项证据支持了这一观点。与我们的果蝇研究结果一致，GF小鼠血浆中胰岛素水平低于对照组小鼠，血清中柠檬酸、富马酸和苹果酸水平较低，亚油酸和软脂酸水平较高；GF小鼠也表现出类似的模式，氨基酸和TAGs增加，34-38个碳的磷脂酰胆碱减少。肠道细菌对果蝇和哺乳动物能量产生途径的影响之间的相似性可能反映了来自细菌维生素的线粒体辅酶的高度保守的影响，宿主中细菌因素对能量生产的贡献也与最近对人类中细菌对热量生产的贡献相一致。
将我们的发现与线粒体对生殖解剖结构大不相同的物种卵子发生的影响进行比较表明，细菌-线粒体连接对卵子发生的调节也是保守的，例如，哺乳动物中的线粒体活性对于卵母细胞成熟，受精和胚胎发育是必需的；线粒体功能障碍，以及不平衡的葡萄糖水平和高TAG和脂肪酸水平，与减数分裂缺陷和小鼠卵母细胞的发育延迟有关；与果蝇的卵发生类似，哺乳动物卵母细胞的发育依赖于卵泡中卵母细胞周围的体细胞颗粒丘细胞，这些细胞为卵母细胞提供碳水化合物、脂类、氨基酸和ATP。卵泡微环境也是影响人类卵母细胞发育潜能的主导因素，卵丘细胞分析被认为是评价卵母细胞能力和质量的首选非侵入性策略。
结论
本研究结合胰岛素信号传导，营养传感和线粒体辅因子的保守性，为保守的细菌线粒体轴调节宿主能量产生和卵子发生提供了强有力的支持。