坦索罗辛降低输尿管平滑肌的收缩活性的机理？
坦索罗辛通过降低输尿管平滑肌细胞 (SMC) 的收缩活性，但又不完全消除输尿管收缩，起到松弛输尿管平滑肌的作用。这种松弛可能允许远端输尿管形成压力梯度，从而有利于结石的排出。然而，接受坦索罗辛的输尿管组织中的 α1-AR 蛋白水平没有显着变化，表明收缩的减少不是发生蛋白水平。而是在细胞内系统。
Transl Androl Urol. 2021 Jul; 10(7): 2953–2961.
doi: 10.21037/tau-20-1342
PMCID: PMC8350256
PMID: 34430398
Mediators of human ureteral smooth muscle contraction—a role for erythropoietin, tamsulosin and Gli effectors
Kymora B. Scotland,1 Samir Bidnur,2 Lu Wang,3 Ben H. Chew,2 and Dirk Lange2
Abstract
背景 输尿管收缩是一个知之甚少的过程。收缩已被证明发生在输尿管的平滑肌层。以前的工作表明 Gli 家族蛋白和促红细胞生成素 (EPO) 参与调节哺乳动物输尿管平滑肌收缩。我们试图设计一种方法，通过该方法可以研究这些蛋白质和坦索罗辛对人类输尿管远端组织收缩力的影响，以更好地了解调节人类输尿管功能的机制。方法 获得了 IRB 的批准，可以从活体供肾移植中获取部分外来远端输尿管组织。通过将组织置于 Krebs 缓冲液中并通过均匀电流刺激来测量收缩性。在存在和不存在 Gli 抑制剂 (GANT61) 或 EPO 的情况下，记录每次刺激时的收缩力。随后固定每个输尿管标本并通过免疫组织化学测试以确定 Gli、EPO 和 α-肾上腺素能受体活性。结果 电场刺激成功地引起输尿管组织收缩。给予坦索罗辛降低了输尿管收缩的力量和持续时间。与未处理的对照相比，在给药后 5 分钟内抑制 Gli 信号会降低收缩力，EPO 会降低输尿管收缩力。染色证实输尿管平滑肌和上皮组织中 Gli1 蛋白和α-肾上腺素能受体表达，EPO 受体表达仅限于上皮层。结论 通过抑制 Gli 家族蛋白和 α-肾上腺素能受体，远端输尿管收缩力降低。EPO 在五分钟内起作用，表明离子通道参与而不是基因表达的变化。后续工作将阐明这些蛋白质在协调输尿管收缩中的作用。这对使用药物方法来解决结石排出、输尿管镜检查、移植患者的输尿管收缩性和蠕动功能障碍以及可能减轻输尿管支架引起的症状具有重要意义。关键词：输尿管蠕动，输尿管平滑肌，促红细胞生成素，坦索罗辛
Introduction
输尿管蠕动是尿液从肾脏排出到膀胱的过程，继发于输尿管壁平滑肌收缩 (1)。蠕动波在输尿管中传播的机制尚不清楚。分离的输尿管组织标本先前已在体外实验中显示具有自发收缩活性 (2)。这意味着蠕动收缩的传播主要由输尿管壁的平滑肌细胞 (SMC) 控制。输尿管平滑肌细胞的收缩能力对于允许尿液从肾脏移动到膀胱至关重要。蠕动在各种现象中很重要，例如结石排出和先天性疾病，例如巨输尿管和输尿管盆腔连接部阻塞 (3)。我们小组的研究表明，单侧输尿管梗阻逆转后输尿管蠕动的恢复在肾积水消退后延迟了 8 天，在梗阻逆转后延迟了 11 天 (4)。鉴于由于梗阻或先天性问题导致输尿管蠕动中断对肾功能、健康和患者发病率的显着负面影响，有必要提高我们对这一过程中主要分子参与物的理解，以确定未来的潜在目标旨在加速结石或先天性疾病手术干预后蠕动恢复的治疗剂。 输尿管中的机电耦合先前已被研究过 (5)。已知平滑肌收缩的一般机制涉及钙的作用以激活肌细胞内的肌球蛋白 (6)。输尿管 SMC 的收缩传播被认为涉及钙和钙离子通道的作用 (7)，这一理论得到了使用钙通道阻滞剂硝苯地平 (8) 的实验的支持，该药物已成功用于治疗肾绞痛减少蠕动 (9)。 在这项研究中，我们旨在通过研究三种假定的蛋白质调节剂在基于先前文献研究的人类输尿管组织蠕动活动中的作用，开始扩展我们对输尿管平滑肌驱动力产生机制的了解。第一种蛋白质，α1 肾上腺素能受体 (α1-AR) 早就知道在这个过程中发挥作用，但实际的机制研究很少。此外，我们实验室和其他人的研究表明促红细胞生成素 (EPO) 和 Gli 蛋白在介导输尿管收缩中发挥作用 (4,10,11)。 坦索罗辛是一种 α1-AR 拮抗剂，常用于急性肾结石发作患者。最近的前瞻性研究对其在药物驱除疗法中的益处表示怀疑 (12)。然而，有证据支持 α 受体阻滞剂可有效排出远端输尿管结石的论点 (13,14)。虽然预计它会通过阻断 α1-AR 起作用，但其确切的作用机制尚不清楚。促红细胞生成素已被证明在肠道平滑肌的蠕动活动中起作用 (15,16)。已知促红细胞生成素受体存在于肾脏中 (17)，我们最近证明了 EPO 在小鼠输尿管中的表达 (4)。虽然 EPO 的非造血作用机制目前尚不清楚，但我们认为它可能以类似的方式在输尿管和肠道平滑肌细胞中发挥作用。因此，我们假设暴露于 EPO 会调节正常人输尿管的蠕动活动。最后，Gli 家族蛋白是 Sonic Hedgehog-Gli 通路的下游效应子，已知在胎儿组织模式中发挥作用 (18)。其他工作揭示了 Gli3 突变小鼠肾积水、输尿管积水和输尿管运动障碍 (19)。我们的小组之前已经发现 Gli1 在输尿管支架植入后成年猪输尿管蠕动中的潜在作用，这会形成部分阻塞 (20)。在这里，我们研究了 Gli 蛋白、EPO 和坦索罗辛对远端输尿管组织收缩能力的影响，以更好地了解它们在介导平滑肌收缩和蠕动中的作用。总的来说，这里介绍的研究旨在利用从我们实验室和其他人以前的研究中收集的知识，暗示 EPO、Gli 和 α1-AR 在介导输尿管蠕动中的作用，并研究它们对输尿管平滑肌和蠕动产生力的作用。
Methods
该研究是根据赫尔辛基宣言（2013 年修订）进行的。该研究得到了机构临床研究伦理委员会（编号：H16-01561）的批准，并且所有患者都知情同意从活体供肾移植中获取部分外来远端输尿管组织。样本在发布前进行了去标识化处理，并且没有获得或存储与患者或捐赠者有关的数据，因为本研究不需要患者信息。总共对来自 18-65 岁之间的 26 名不同健康活体捐赠者的外来组织进行了实验。将组织立即放置在靠近手术室的 4 摄氏度的 Krebs 缓冲液中，然后转移到冰冷的保温容器中。实验在获得组织的 24 小时内进行。在专为评估平滑肌收缩而设计的电场刺激 (EFS) 设备中评估输尿管组织收缩性（图 1）。每种处理都在包含不同生物样本的三个独立实验中进行测试，每个参数至少运行 3 次。将组织脱脂并准备在垂直安装在组织浴中的大约 1 毫米厚的环中，一端固定在固定钩上，另一端固定在长度-力传感器的伺服控制杆上。这样做是为了使组织与电极平行（图 1）。组织浴包含 37 °C 的 Krebs 缓冲溶液，用 95% O2-5% CO2 混合物鼓泡。Krebs 溶液组成为：118 mM NaCl、4 mM KCl、1.2 mM NaH2PO4、22.5 mM NaHCO3、2 mM MgSO4、2 mM CaCl2 和 2 g/L 葡萄糖（pH 7.4）。输尿管组织以最小的被动静息张力保持在原位长度 (10,21)。肌肉准备平衡一小时。然后肌肉被 EFS 激活。使用带有铂电极的 60 Hz 交流刺激器实现了均匀的电流。每次拉伸后都会引起等长收缩。表征肌肉的经典长度-张力关系，并记录每次刺激时在 DMSO 溶剂（Sigma-Aldrich , 密苏里州圣路易斯市)、20 IU 人类生物合成依泊汀 alphaEPO (Eprex 2,000 IU/0.5 mL, Janssen Inc, Beerse, Belgium)、2 mM 氯化钙 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 或通用坦索罗辛 1 μM 在 DMSO 溶剂中。DMSO 以前曾在类似研究中用
作溶剂 (22,23)。GANT61 和坦索罗辛实验中的对照组织经受 DMSO。
Figure 1 电场刺激。将输尿管组织置于带有水套的生理克雷布斯缓冲溶液的组织浴中，以保持温度在 37°C。力传感器测量输尿管产生的力。
免疫组化
每个输尿管标本随后固定在 10% 福尔马林中并包埋在石蜡中。切割 5 µm 厚的切片，在二甲苯和酒精系列中脱蜡，然后在 Tris 缓冲盐水中洗涤。用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复并封闭内源性过氧化物酶。一抗在4℃孵育过夜。一抗：α-平滑肌肌动蛋白（稀释 0.13 µg/mL）、Gli 1 抗体 NBP2-45872 稀释 6.67 µg/mL（Novus Biologicals，Abingdon，英国）、EPO 受体抗体 sc-365662 稀释 4 µg/mL（圣克鲁斯） Biotechnology, Dallas, TX)，α 1 肾上腺素能受体抗体稀释 2.5 µg/mL 抗体 PA5-33327（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）。洗涤后，切片与适当的二抗在室温下孵育 30 分钟。使用 Leica Multistainer 扫描仪（Leica Biosystems，Wetzlar，德国）进行图像捕获，并使用 Aperio ImageScope 软件版本 12.3.3.5048（Leica Biosystems，Wetzlar，德国）实现蛋白质定量。通过分析整个切片进行蛋白质定量。统计分析 使用非配对 t 检验确定统计显着性，显着性设置为 P<0.05（双尾）。
结果
从活体供肾移植中采集的远端输尿管组织受到电场刺激。向组织浴中添加额外的钙盐会导致收缩力增加（图 2，P=0.043）。与对照组织相比，接受 Gli 蛋白抑制剂 GANT61 的组织表现出收缩性降低（图 3，P=0.039）。在孵育一小时时注意到收缩力差异。
Figure 2
钙给药对输尿管收缩力的影响。(A) 控制输尿管中电场刺激后的收缩力。(B) 输尿管受到氯化钙的电场刺激后的收缩力。(C) 相对收缩力（绝对力/面积）的定量；P=0.043。这个实验进行了 3 次。标本 n=3，对照 n=1。* 表示 P<0.05。
Figure 3
Gli 抑制对输尿管收缩力的影响。(A) 控制输尿管中电场刺激后的收缩力。(B) 输尿管受到 GANT61 的电场刺激后的收缩力。(C) 相对收缩力（绝对力/面积）的定量；P=0.039。这个实验进行了九次。标本 n=6，对照 n=3。* 表示 P<0.05。与对照相比，添加 EPO 导致输尿管收缩力降低（图 4，P=0.042）。这在孵育五分钟时被注意到。类似地，坦索罗辛导致收缩性降低（图 5，P=0.048），但并未完全延迟收缩。这在给药后一小时内被注意到。
Figure 4
EPO对输尿管收缩力的影响。(A) 控制输尿管中电场刺激后的收缩力。(B) 输尿管受 EPO 电场刺激后的收缩力。(C) 相对收缩力（绝对力/面积）的定量；P=0.042。这个实验进行了九次。标本 n=6，对照 n=3。* 表示 P<0.05。
Figure 5
α-肾上腺素能受体抑制对输尿管收缩力的影响。(A) 控制输尿管中电场刺激后的收缩力。(B) 输尿管接受坦索罗辛电场刺激后的收缩力。(C) 相对收缩力（绝对力/面积）的定量；P=0.048。这个实验进行了九次。标本 n=6，对照 n=3。* 表示 P<0.05。 进行免疫组织化学 (IHC) 以研究收缩力的变化是否与相关蛋白质表达的差异相关。IHC 分析表明，受 GANT61 影响的输尿管组织中 Gli1 表达的非显着增加（图 6A、B、C）。类似地，与施用促红细胞生成素的对照相比，EPO 受体蛋白水平增加（图 6 D、E、F），但这并不显着。表达主要位于上皮层。与对照输尿管组织相比，坦索罗辛给药后 α1-AR 的蛋白质表达没有变化（图 6 G、H、I）。
Figure 6免疫组织化学。电场刺激后输尿管组织的蛋白质表达。(A) Gli1 在控制输尿管组织 n=2。(B) 受 GANT61 n=3 影响的输尿管组织中的 Gli1。(C) 经 GANT61 处理的输尿管组织中的 Gli1，放大 20 倍，插图放大 40 倍。(D) 对照输尿管组织中的 EPO 受体 n=2。(E) 受 EPO 影响的输尿管组织中的 EPO 受体 n=3。(F) EPO 输尿管组织中的 EPO 受体，放大 20 倍，插图放大 40 倍。(G) 对照输尿管组织中的 Alpha-1D 肾上腺素能受体 n=2。(H) 接受坦索罗辛 n=3 的输尿管组织中的 Alpha-1D 肾上腺素能受体。(I) 输尿管组织中的 Alpha-1D 肾上腺素受体，坦索罗辛放大 20 倍，插图放大 40 倍。(J) Gli1 表达的定量，P=0.10。(K) EPO 受体表达的定量 P=0.08。(L) α-肾上腺素能受体表达的定量 P=0.13。
Discussion
输尿管在泌尿系统中起着至关重要的作用，因为它们将尿液从肾脏输送到膀胱进行储存直至排尿。部分或完全梗阻导致输尿管功能障碍，表现为蠕动停止。先前的工作表明，在梗阻逆转和肾积水消退后，蠕动恢复到梗阻前水平显着延迟，这表明对排尿和可能的肾功能的负面影响会延长 (4)。需要更好地理解驱动输尿管蠕动的机制以及目前使用的药物方法来操纵输尿管功能所引发的机制，以开发更有效的方法来在手术前和/或术后调节输尿管蠕动。本研究旨在通过评估当前使用的干预措施和通过先前工作确定的可能替代方案对人类输尿管平滑肌功能的影响，增加我们对这一过程的理解。 远端输尿管收缩力随着钙的给药而增加，这一发现支持了其他组的先前数据，表明钙信号传导介导蠕动。输尿管电活动的离子基础尚不完全清楚，但被认为涉及 L 型钙通道 (24)。这种 SMC 兴奋可能与收缩相结合，电活动以细胞到细胞的方式传播，随后的收缩向远端移动到输尿管中其他不活动的 SMC。这种运动会产生收缩波，尿液从肾脏沿着输尿管向下推进到膀胱进行排尿 (6)。在这项研究中，钙的施用作为阳性对照，以确保组织是有活力的，并且能够对自然已知会引发收缩的刺激做出反应。 坦索罗辛是一种 α1D-AR 抑制剂，其在肾绞痛治疗中的作用被认为是其 α1 阻断的结果。在这里，我们已经证明坦索罗辛确实降低了人类输尿管组织中输尿管收缩的力量（图 5）。这与 Weiss 等人的工作一致。显示了酚妥拉明的类似作用机制 (24)。此外，Troxel 等人之前的一项研究。研究坦索罗辛对猪输尿管的影响发现，它降低了猪输尿管的收缩幅度并增加了收缩间隔。在目前的研究中，坦索罗辛给药对宫缩持续时间没有显着影响（数据未显示）。我们提出，坦索罗辛通过降低输尿管 SMC 的收缩活性而不完全消除输尿管收缩，起到松弛输尿管平滑肌的作用。这种松弛可能允许远端输尿管结石的排出。我们在此尝试调查基于坦索罗辛给药的 α1-AR 表达是否发生变化的研究表明，与对照相比，接受坦索罗辛的输尿管组织中的 α1-AR 蛋白水平没有显着变化，表明收缩的减少不是蛋白质水平。 α1D-AR 表达是细胞内的，如先前所证明的 (25)。有必要进一步研究阻塞输尿管中 α1-AR 的表达，以进一步扩展我们对坦索罗辛在该过程中的功能的理解。 EPO 先前已被证明可通过增加对乙酰胆碱给药的收缩力来改善肠道运动障碍 (15)。我们的小组在输尿管梗阻的小鼠模型中显示了 EPO 给药后输尿管运动的类似改善 (4)。在这项使用非阻塞输尿管组织的研究中，我们证明 EPO 降低了“正常”未受伤人类输尿管组织的输尿管收缩力。在阻塞和未阻塞组织中都可以看到 EPO 的作用这一事实高度暗示其在调节一般输尿管收缩性方面的作用，进一步表明可能针对 EPO 诱导的信号传导进行干预的潜力。 注意到 EPO 在给药后 5 分钟内降低收缩性，表明其对输尿管收缩性的调节是通过快速作用机制发生的。这项工作的一个新发现是 EPO 受体在人类远端输尿管上皮中的表达。在 IHC 上，与对照组织相比，EPO 受体的表达有增加的趋势，这表明作用机制可能利用该受体。在细胞膜和细胞内观察到 EPO 受体表达，这与其作为具有细胞内结构域的跨膜受体的作用一致 (26)。据我们所知，非造血 EPO 活性的这种快速激活以前没有被证明涉及 EPO 受体 c 挂起。有趣的是，EPO 主要在上皮中鉴定，同时影响输尿管收缩。有证据表明，除了通过传统 EPO 受体发挥活性外，EPO 蛋白还利用 β 共同受体和阳离子通道受体发挥其某些功能 (27,28)。其他人已经表明，促红细胞生成素的生物活性与非上皮组织的下游效应有关 (29)。我们认为人类输尿管可能就是这种情况。将做进一步的工作来表征其在输尿管组织中的活性机制。 在本研究中，Gli 抑制剂 GANT61 的给药导致输尿管组织收缩力降低（图 3）。这与刺猬信号可能在介导输尿管收缩中起作用的假设一致。该输尿管组织中 Gli1 蛋白的 IHC 分析表明 Gli1 在成人输尿管中表达。与对照相比，在施用 GANT61 后 Gli1 水平似乎没有显着差异（图 6）。这可能部分由 GANT61 活性的机制解释，该机制阻止 Gli 蛋白与 DNA 的翻译后结合，而不是 Gli1 蛋白表达 (30)。因此，使用免疫组织化学确定的 Gli1 蛋白表达水平保持不变也就不足为奇了。Gli1 表达在细胞内，与之前的工作一致 (10)。 本研究是作为关键的第一步进行的，以更好地了解先前确定的潜在蠕动调节因子影响人类输尿管平滑肌收缩的作用。已证明特定蛋白质的表达在输尿管的不同区域有所不同 (31)。由于组织是从活体移植捐献者的远端输尿管中获得的，这是该研究的一个局限性。总的来说，我们已经证明 EPO、Gli1 和 α1-AR 的操作对人输尿管平滑肌功能有影响。为了充分阐明输尿管收缩的电和机械基础，以及如何操纵 EPO、Gli 和 α1-AR 相关信号以促进手术干预后正常输尿管蠕动的恢复，必须在正常输尿管和阻塞输尿管中进行进一步的工作。清除阻塞性结石和/或纠正影响输尿管功能的解剖异常。
Conclusions
Gli 蛋白和 α1-AR 抑制剂可降低远端输尿管收缩力。EPO 在短时间内降低输尿管收缩力，表明离子通道参与而不是基因表达的变化。EPO 对输尿管收缩的影响可能至少部分通过 EPO 受体起作用。正在进行的工作旨在阐明 Gli 蛋白、EPO 和 α1-AR 在调节输尿管收缩中的作用。