神奇的肠道 | 杀死有害菌、保护共生菌，调节人体免疫
神奇的肠道——杀死有害菌，保护共生菌
人体肠道内居住着多达百万亿的细菌“居民”，仅仅一“墙”之隔就是富含固有和适应性免疫细胞的肠道固有层，而这道“墙”只是一层肠上皮细胞（intestinal epithelial cells，IECs）。肠道中的这些细菌既有通常无害的共生菌，又有致病菌，它们的很多分子特征都是相同的，而且都可以被免疫细胞的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）所识别并结合。免疫系统在抗击病原菌的同时，是如何恰当地进行调节以不伤害共生菌群的？如果免疫系统不能应对病原菌的攻击，机体的肠道屏障就极有可能被攻破，从而引发全身感染；而如果免疫应答过激，则会牵连共生菌群，导致组织损伤和菌群失调，并促使炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的发生。
目前的观点认为，粘膜免疫系统既有能力对病原菌产生有力的保护性应答，与此同时又对共生菌耐受。而且这一过程必须在生物多样性动态平衡的背景下实现，因为随着不同食材的摄入，肠道内环境改变，肠内微生物多样性也会随之快速波动。
细菌分解膳食纤维的副产物——SCFA
人们很早以前就已经认识到了共生菌对消化植物淀粉、胆汁酸产物以及为机体提供维生素的必要性。这些过程中会有很多副产物产生，而观察发现，IBD患者体内的这些副产物相对较少，那么这些微生物代谢产物是否决定了肠道的免疫状态呢？很多研究团队都对这一问题进行了探究。2014年的《美国国家科学院院刊》上，美国耶鲁大学医学院的Chang PV等发表的一篇论文发现，细菌对淀粉进行无氧酵解所产生的最终产物——n-丁酸，一种短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA），能起到抗炎的作用，并且能抑制肠内巨噬细胞所引起的促炎反应。
在这项研究中，Chang PV等证实，结肠内富集程度非常高的一种细菌代谢产物n-丁酸能够通过抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）调节肠巨噬细胞的功能。n-丁酸作为细菌的“信使”，告诉宿主的免疫系统产丁酸菌已经达到了一定水平。而HDAC负责做n-丁酸的“感受器”，大量n-丁酸导致的HDAC抑制最终会引起肠巨噬细胞减少促炎因子（如IL-6、IL-12）的产生，其效果就是肠道免疫系统对这些友好的产丁酸菌不产生炎症应答。而一旦缺少这些有益的细菌，固有层巨噬细胞就会通过产生促炎因子来清除它不欢迎的菌群，改造肠内的菌落环境，直到再次形成最佳的微生物平衡，n-丁酸水平回归到理想范围。
这一发现联合其他一些新出现的证据共同提示，某些种类的细菌能够通过它们的代谢产物来左右免疫系统，从而影响免疫应答的程度和性质。
SCFA促使Treg生成
此前一直认为，特定种属的细菌与肠组织内某些T细胞亚群的出现有关。例如，给小鼠只植入单一一种共生菌——分节丝状菌（segmented filamentous bacteria，SFB）就足以诱导CD4+T细胞Th17亚群的产生（如下图中的A）。这类细胞分泌促炎细胞因子IL-17和IL-22，可促使抗菌肽的产生、促进组织修复，并增强抗枸橼酸杆菌感染的能力。另一种途径也可以促使Th17细胞的产生——肠道固有层内的树突状细胞（dendritic cells，DCs）感受到肠腔内细菌来源的ATP，从而增加IL-6和IL-23的表达，这些细胞因子便具有诱导Th17产生的作用(如图A）。然而，SFB定植鼠肠内ATP的水平并没有增加，这提示，多种能感受到特定微生物定植的途径最后都能诱导出同样的免疫表型。这一结论同样适用于结肠内调节性T（regulatory T，Treg）细胞的产生。
日本理化学研究所（RIKEN）综合医学研究中心的Atarashi K等2013年发表于《自然》上的文章显示，从人的粪便中分离出梭菌属IV、XIVa及XVIII簇细菌，并将其植入小鼠，可提高小鼠肠内Treg细胞的富集程度，还能增加细胞因子IL-10等抗炎分子的产生（如图B）。把得自于这些小鼠的盲肠提取物应用于人体及鼠IEC细胞系可导致转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1的产生，TGF-β1是肠内参与Treg细胞分化的一种主要细胞因子。这种盲肠提取物中含高浓度的SCFA，而体外实验显示，给IECs加入由纯化乙酸、丙酸和丁酸（都是SCFA）组成的混合物同样能诱导TGF-β1的产生。这些结果提示，梭菌属细菌代谢产生的SCFA或许才是Treg细胞计数增加的原因。
无独有偶，哈佛公共卫生学院的Smith PM等2013年发表于《科学》上的研究也得出了类似的发现：口服SCFA时，可通过结肠Treg细胞上表达的短链游离脂肪酸受体——G蛋白藕连受体43（G protein-coupled receptor 43，GPR43）促进Treg细胞扩增，为实验性结肠炎模型提供保护。而在此之前，炎症反应的减轻被认为是由微生物代谢产生的乙酸通过表达于中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上的GPR43所介导。GPR43信号被认为可抑制炎症反应，在结肠炎、炎症性关节炎及过敏性呼吸系统疾病的动物模型中可使病情得到改善。
SCFA的抗炎效果不仅可以通过与G-蛋白藕连受体（G protein–coupled receptors，GPCRs）结合这一途径产生，而且现已证明还可以不依赖于GPCRs机制。2013年，两项发表于《自然》上的研究——分别由日本RIKEN的Furusawa Y等和美国纪念斯隆-凯特林癌症中心的Arpaia N等开展——均证实，SCFA对HDAC活性的抑制可导致从CD4+幼稚T细胞前体开始的Treg细胞从头生成过程（如图B）。这完全不同于GPR43信号作用下的对结肠已有Treg细胞池的扩增。每种SCFA诱导Treg细胞生成的能力都与HDAC被抑制的程度呈正相关，n-丁酸的能力最强。HDAC被抑就导致诱发Treg细胞所需的基因位点内的组蛋白H3乙酰化增加，从而使这些基因的转录上升。此外，用丁酸预处理的DC，促炎信号明显减少，而且在丁酸和TGF-β1共同存在的情况下，会进一步促使幼稚CD4+T细胞转化为Treg细胞。
n-丁酸对肠巨噬细胞的作用
根据Chang等的这项研究，n-丁酸对肠巨噬细胞的抗炎作用也取决于HDAC抑制，并与组蛋白3第9赖氨酸的乙酰化（histone 3 lysine 9 acetylation，H3K9Ac）水平升高相关（如图C）。
肠巨噬细胞是肠道固有层内最丰富的免疫细胞类型，由于它们不能增殖，所以只能从循环单核细胞池中招募、补充。然而，不同于循环单核细胞及其他组织中的巨噬细胞，肠巨噬细胞上的Toll样受体（toll-like receptor，TLR）对刺激的敏感性较低，应答并不充分。这些都提示，肯定有某种活性过程在骨髓来源细胞到达肠道固有层后抑制了其炎症应答反应，导致在这一存在微生物信号的小环境中，TLR对配体的应答不足。
Chang等的研究给出了其中的原因。首先，用n-丁酸处理骨髓来源巨噬细胞(bone marrow–derived macrophages，BMDMs)后，就足以使其在应对细菌内毒素——脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)时，TLR与之结合后所诱发的炎症反应减轻。随后，用广谱抗生素治疗小鼠来清除由细菌群落所产生的SCFA，再给它们中的一部分补充n-丁酸，另一部分只是补充些充当安慰剂的赋形剂，结果显示，肠巨噬细胞反应性的降低取决于SCFA的存在，如果没有SCFA则肠巨噬细胞就会重新获得对LPS应答的能力。
如上所述，这一效果的产生取决于n-丁酸的HDAC抑制活性，当用一种经典的HDAC抑制剂——曲古霉素A（trichostatin A，TSA）处理BMDM时，也会出现类似的效果。有趣的是，n-丁酸作用下巨噬细胞反应性的降低并非是由于全部基因的表达都受到了影响。只有LPS次级反应基因（secondary response genes，SRGs），例如Il6的转录是被削弱的。
LPS通过巨噬细胞上的TLR可以诱导数百种基因的表达，这些基因的表达按照是否需要新蛋白的合成又可以被分为两个阶段：初级反应基因（primary response genes，PRGs）和SRGs。PRGs通常在刺激发生1小时内转录表达，而SRGs由于要等待新蛋白合成及启动子处染色质重构，所以其表达是延迟的。
在n-丁酸作用下，巨噬细胞内作为LPS PRGs的Tnfa和Ccl2——这两种基因分别编码TNF-α和单核细胞趋化因子1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），都不受n-丁酸的影响。相反，编码促炎细胞因子IL-6和IL-12p40的SRG基因在暴露于n-丁酸时受到了强烈的抑制。
有人提出，SRG表达的调节可能是细胞系特异性的。n-丁酸可能通过协调染色质修饰来提高核小体改构的阈值，从而实现对SRG的选择性抑制。Chang等的研究结果支持了这一假说，他们的研究显示，n-丁酸暴露后，基因Il6和Il12b位点都出现了H3K9Ac的累积。尽管组蛋白乙酰化是与转录激活相关的，但也有报道称，H3K9Ac修饰可使Mi-2β增加，这是一种Mi-2/NuRD共抑制复合物，在HDAC被抑制的时候其表达上调。更重要的是，Mi-2β在SRG位点的聚集会使LPS介导的SRG基因表达上调得到抑制。
Chang等的这项工作提供了一种前所未有的机制，解释了为什么肠巨噬细胞对肠腔内的细菌刺激反应性低，也再一次证明了正是微生物代谢产物使肠道对共生菌形成了耐受机制。然而，这项研究最有意思的部分在于，发现这种低反应性是有选择的。肠巨噬细胞仍然可以产生正常水平的TNF-α和MCP-1，保有噬菌和杀菌活性。如果有兴趣的话，你可以思考一下，这些基因为什么通过进化选择“逃”过了n-丁酸介导的转录抑制。在这个问题上，一种很吸引人的假说是，TNF-α和MCP-1能够促使单核细胞和中性粒细胞向肠组织募集，而这些细胞还未被SCFA所影响，一旦肠道屏障被破坏，就能够随时产生促炎因子以应对侵入的细菌。由此导致的炎症环境就可以克服由其他固有和适应性免疫细胞，主要是Treg细胞，营造出的免疫抑制局面了，从而使得在免疫耐受状态下发生炎症应答有了可能，而这种应答是清除感染、开启组织修复所必须的。
细菌通过代谢产物与宿主联系
Chang等的研究连同最近这几项分别由日本RIKEN的Atarashi K等、哈佛公共卫生学院的Smith PM等以及纪念斯隆-凯特林癌症中心的Arpaia N等开展的研究，无不突出了细菌代谢产物的多效性——这些代谢物在不同细胞类型的多条信号通路中都有参与，并能使固有和适应性免疫细胞应答不对共生菌群产生威胁。这些研究“翻译”出了宿主和共生菌之间互相“交流”的化学“语言”，对特定微生物代谢物是如何影响宿主不同类型细胞这一问题给出了答案。而这又给科研人员提供了一个激动人心的研究领域，他们可以继续探索以破解共生生物间相互沟通的密码。
参考文献：Proceedings of the National Academy of the Sciences 2014;111:2058-2059