精准诊疗 | 数字PCR掀起新热潮
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☞ PCR技术发展简史
☞ 数字PCR技术简述
☞ 数字PCR性能表现评估简析
PCR技术发展简史
PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）技术起源于20世纪70、80年代。在过去的 100 年里，PCR技术的发明给生命科学带来巨大的改变，成为生物学和遗传学研究史上的里程碑事件[1]。
经过几十年的发展，经历了第一代的终点法PCR、第二代荧光定量PCR和第三代数字PCR的演变，PCR技术的应用从早期的生命科学研究迅速扩展到医疗筛查诊断、遗传学分析、法医分析鉴定及食品卫生和环境检测等方面。（图1）
图1 PCR技术发展历程（图片来源：dPCR: A Technology
Review. Sensors (Basel). 2018 Apr 20;18(4):1271.）
数字PCR技术简述
20世纪末，Vogelstein等提出数字PCR( digital PCR，dPCR) 的概念：通过将一个样本充分稀释，分配到不同的反应单元，每个单元包含少于或等于一个拷贝的目标分子( DNA模板) ，在每个反应单元中对目标分子进行单独、平行的PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，以实现绝对定量及稀有等位基因的检测[2]（图2）。
与第一、二代PCR技术相比，
数字PCR具有很多优势[3]：
1. 特异性、灵敏性均有显著提高；
2. 在不依赖内参和标准曲线的前提下，可直接得到绝对量化指标；
3. 微反应单元相互独立、封闭，避免了PCR抑制剂及不同核酸分子扩增产物间的相互干扰，极大的提高了检测的准确度和可重复性。
图2 数字PCR示意图（图片来源：dPCR: A Technology
Review. Sensors (Basel). 2018 Apr 20;18(4):1271.）
数字PCR性能表现评估简析
数字PCR技术因其显著优势在临床上的多个领域展现出良好的应用前景。那么当一项真正的数字PCR实验在开展的时候，有哪些指标可以用来评估该实验的性能表现，从而确保该产品充分发挥出数字PCR技术的性能优势呢？
根据微反应单元的不同形式，数字PCR产品可分为微板式、微滴式和芯片式等。不论是哪种形式的数字PCR产品，整体上都由微反应单元生成和扩增信号检测与分析两个部分组成。
数字PCR的性能评价指标大多与荧光定量PCR重叠。数字PCR与qPCR主要的差别在于微反应单元生成和阴阳性信号确定。因此，数字PCR产品性能评估主要从以下两个方面展开：
指标一：有效微反应单元数
数字 PCR 基于有限稀释的概念，将一个反应分成大量微反应单元，从而通过分区过程将各个目标模板分开。在每个微反应单元独立完成扩增后，通过光信号检测将每个微反应单元确定为正（目标存在）或负（目标不存在）。目标分子在分区的过程中遵循泊松分布原理，因此可以根据阴性和阳性微反应单元的数目来计算初始目标数量。泊松统计依赖于两个假设：(1) 所有微反应单元具有相同的体积；(2) 目标序列随机分布到每个微反应单元中[3]。
材料学技术的发展和进步使得微反应单元的体积误差被控制在很低的水平，有效微反应单元的数目会对数字PCR检测结果的准确性产生直接的影响。由图3可见，有效微反应单元的数目越多，检测结果的偏差越低。同时，对检测结果准确性产生影响的还有每个微反应单元的平均模板数量，在有效微反应单元数目大于10000、每个微反应单元的平均模板数量为1.6的时候，数字PCR检测的准确性是非常高的。这就要求在进行数字PCR实验之前，需要对待测样本中的模板拷贝数进行预估，模板浓度过高的样本应预先进行稀释，使得平均模板数量落在合理的区间内，避免出现阳性模板过载而导致检测失败的情况出现。
综上所述，更高的有效微反应单元数不仅可以提高数字PCR检测的准确性，还可以扩大数字PCR检测的动态范围，降低高浓度样本“爆仓”的可能。
图3 微反应单元数与数字PCR检测准确性
（图片来源：dPCR: A Technology Review.
Sensors (Basel). 2018 Apr 20;18(4):1271.）
指标二：信号区分度相关指标
数字PCR对模板的绝对定量是基于对每个微反应单元进行阴阳性判别后结合泊松统计计算所得，因此对于阴阳性微反应单元的准确识别，将会对数字PCR结果的准确性产生直接影响。而在实际的检测中，经常碰到微反应单元阴阳性确定上的难题，如阴阳性信号界限不清、阳性信号簇不单一或者大量分布在阴阳信号之间的中间态（rain）的现象。
图4 阴阳性微反应单元难以确定
（图片来源：Use of ddPCR in experimental
evolution studies. Methods in Ecology
and Evolution 2016, 7, 340–351. ）
图5 过高的中间信号微反应单元比例
（图片来源：The Future of Digital Polymerase Chain
Reaction in Virology. Mol Diagn Ther.
2016 Oct;20(5):437-47. ）
图6 扩增产物不单一
（图片来源：Measuring Digital PCR Quality:
Performance Parameters and Their Optimization.
PLoS One. 2016 May 5;11(5):e0153317.）
因此，在开展一项数字PCR检测实验的时候，我们需要对检测信号进行评估和分析，以便确定数据的有效性从而设计对应的优化方案。这些评估指标主要包括：Band width/tightness，SNR（signal to noise ratio）， Rain percentage，RFI（relative fluorescent intensity），Peak resolution.
图7 数字PCR分辨率
（图片来源：Measuring Digital PCR Quality:
Performance Parameters and Their Optimization.
PLoS One. 2016 May 5;11(5):e0153317.）
Band width/tightness：
用于描述扩增后阴阳性微反应单元的荧光信号集中度，数值越低表示微反应单元间信号差异越小，扩增体系稳定性越好。
SNR（signal to noise ratio）
用于描述目标信号与噪音之间的比例。需要注意的是阳性和阴性信号均属于目标信号，需分别计算信噪比，与band width/tightness类似，主要用于评估信号的集中度。
Rain percentage
用于描述出现在阴性和阳性微反应簇之间部分的比例，通常是由于实验体系优化不佳导致，rain percentage应尽可能低，可通过体系优化实现。
RFI（relative fluorescent intensity）
用于评估阳性微反应簇和阴性微反应簇荧光强度的差值。RFI越大，说明阳性微反应单元与阴性微反应单元的区分度越好。
Peak Resolution
以上其他指标均是从单一角度对数字PCR微反应单元的信号进行评估，但Peak Resolution分辨率是对阳性和阴性微反应单元区分程度的定量测量，由两个峰之间的荧光差异除以峰的组合宽度可得。
由上述公式可见，有效区分阴阳信号簇的理论最小值为2。分辨率越高，微反应单元被错误划分的可能性越低。影响数字PCR分辨率的因素很多，从硬件光路系统的性能，到反应体系的成分以及反应条件的选择，都会对检测分辨率造成直接的影响。
结语
数字PCR以其明显的技术优势，已经被广泛应用于核酸检测的方方面面。数字PCR在肿瘤液态活检、遗传生殖检测、公共卫生检测、环境微生物检测、RNA表达检测、NGS文库定量、甲基化检测等领域都发挥着越来越重要的作用[2，3]。
工欲善其事，必先利其器。要想充分发挥数字PCR的性能优势，对数字PCR数据的评估是先决条件，只有建立起完善且严格的数字PCR检测流程，才能真正让蓬勃发展的分子诊断如虎添翼！
参考文献：
[1] PCR past, present and future. Biotechniques. 2020 Jul : 10.2144/btn-2020-0057.
[2] dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 2018 Apr 20;18(4):1271.
[3] Digital Assays Part I: Partitioning Statistics and Digital PCR. SLAS Technol. 2017 Aug;22(4):369-386.
[4] Use of ddPCR in experimental evolution studies. Methods in Ecology and Evolution 2016, 7, 340–351.
[5] The Future of Digital Polymerase Chain Reaction in Virology. Mol Diagn Ther. 2016 Oct;20(5):437-47.
[6] Measuring Digital PCR Quality: Performance Parameters and Their Optimization. PLoS One. 2016 May 5;11(5):e0153317.
*仅用于科学研究，不用于临床诊断。TE-CN-00377有效期至2024年8月17日。