MPB：浙大王谦组-​​菌酶一体化重组酵母工程菌的设计与构建

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图1 PCR扩增orf6-un基因Fig. 1 PCR amplification of orf6-un gene泳道1-2, orf6-un基因; M, Marker2.双酶切目的基因和载体使用限制性内切酶分别双酶切载体和基因，酶切体系 (表2)，置于37 °C恒温培养1-2 h，使用产物纯化试剂盒回收酶切产物。表2. 酶切体系Table 2. Enzyme digestion reaction基因/载体1 μg10× Buffer5 μlEnzyme I (10 U/μl)1 μlEnzyme II (10 U/μl)1 μl加ddH2O至50 μl3.目标基因与载体连接利用同源重组的原理，通过TreliefTM SoSoo Cloning Kit同源重组试剂盒将目的基因定向克隆到线性化载体pYD1中，反应体系如表3所示。目标基因与表达载体摩尔比约为5:1，50 °C反应30 min。表3. 同源重组体系Table 3. Homologous recombination reaction纯化回收后的PCR产物(120ng/μl)3 μl线性化载体(80ng/μl)1 μl2× SoSoo Mix5 μl灭菌ddH2O1 μl总计10 μl4.重组质粒的转化4.1将10 μl连接产物与50 μl大肠杆菌TOP10F’感受态细胞小心混匀后，冰浴10~15 min；4.2将离心管置于42 °C水浴热激60 s，立即取出冰浴2~3 min；4.3向离心管中加入500 μl 37 °C预热的灭菌LB液体培养基 (不含抗生素)，混匀后置于37 °C摇床150 rpm恒温培养45 min，使质粒上相关的抗性标记基因表达，菌体复苏；4.4吸取100 μl已转化后的细胞，涂布于具有抗性筛选的LB固体培养基中。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板37 °C恒温培养12~16 h；4.5挑取菌斑进行PCR鉴定，将筛选出的阳性转化子送公司测序。二、酿酒酵母感受态制备1.挑取酿酒酵母EBY100单菌落于5 ml含Amp的YPD液体培养基，30 °C，200 rpm培养过夜；2.取新鲜种子液100 μl接种于含10 ml YPD液体培养基的摇瓶中，30 °C，200 rpm培养至OD600为0.4~0.6；3.4 °C，3,000 rpm，离心5 min，回收菌体；4.倒去上清液，用2 ml灭菌ddH2O反复洗涤两次，4 °C，3,000 rpm，离心5 min；5.倒去上清液，用1 ml的TE/LiAc buffer重悬沉淀；6.倒去上清液，用200 μl的TE/LiAc buffer重悬沉淀，每管分装50 μl，即为酵母感受态。三、LiAc转化法1.向50 μl酵母感受态细胞中加入5 μl重组质粒 (1~1.5 μg)混合均匀，30 °C保温30 min，每间隔10 min混匀一次；2.每管加入1 ml 40% PEG2000，重悬沉淀，30 °C保温1 h；3.42 °C水浴中热激15 min；4.4 °C，12,000 rpm，离心1 min，去上清；5.每管加入1 ml YPD液体培养基，30 °C保温2 h；6.取转化产物100 μl涂布于含亮氨酸的YNB固体缺陷培养基上，待液体被吸收将平板倒置，30 °C培养2~3 d。四、支架蛋白的表面展示1.支架蛋白的表达挑取单菌落于5 ml YNB-CAA液体培养基，30 °C培养12~24 h。按5%的接种量将新鲜种子液接种于50 ml YNB-CAA液体培养基中，30 °C恒温培养12~24 h至OD600为1~1.5。3,500 rpm，4 °C离心5 min收集菌体，使用灭菌ddH2O清洗两次。加入75 ml YNB-CAA液体培养基重悬菌体，并加入终浓度为2%的半乳糖，25 °C诱导48 h后，取上清液和菌体用于后续分析。2.免疫荧光分析将诱导后新鲜的酵母细胞（EBY100/orf6-un）稀释至OD600 = 0.5，设置EBY100为阴性对照。取酵母细胞体积500 μl加入V5标记的鼠抗1 μl，16 °C杂交1 h，1× PBS缓冲液反复清洗5次。加入500 μl的1×PBS缓冲液重悬沉淀，加入2.5 μl FITC标记的IgG兔抗鼠，16 °C避光杂交1 h，1× PBS缓冲液反复清洗5次后。1 ml 1× PBS缓冲液重悬沉淀，置于荧光显微镜下观察拍照（图2）。

图2 免疫荧光分析木聚糖酶ORF6-UN表面展示Fig. 2 Immunofluorescence microscopy analysis of surface-displayed xylanase ORF6-UNA, C: 表面展示细胞EBY100/orf6-un; B, D:阴性对照 EBY1003.流式细胞术分析参照免疫荧光抗体杂交的方法进行抗体杂交，细胞终浓度控制在~106 cell/ml。取300 μl稀释好的带有FITC抗体的酵母细胞于流式上样管中，在激发波长488 nm及发射波长535 nm的条件下，分析荧光细胞的比例。同时设置EBY100为阴性对照[2]。溶液配方1.LB液体培养基称取酵母提取物 (yeast extract) 2.5 g胰蛋白胨 (tryptone) 5.0 gNaCl 5.0 g加500 ml ddH2O溶解，121 °C，20 min加入2.0%的琼脂粉即为LB固体培养基2.0.5 mol/L EDTA (ethylene diaminete traacetic acid)称取1.861 g EDTA·2H2O加入8.0 ml ddH2O，用NaOH调pH至8.0，ddH2O定容至10 ml3.50× TAE (tris base-acetic acid-EDTA) 母液称取Tris 242.0 g冰醋酸57.1 ml0.05 mol/L EDTA (pH 8.0) 100 ml加ddH2O至1,000 ml，将其稀释至1×为工作液4.1× PBS缓冲液 (pH 7.4)称取NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4 1.42 gKH2PO4 0.27 g加800 ml ddH2O溶解，调pH至7.4，定容至1,000 ml5.1 mol/L LiAc称取10.2 g醋酸锂粉末，溶于80 ml ddH2O，定容至100 ml，121 °C，20 min，4 °C保存6.10 mg/mL Leu称取1.0 g亮氨酸粉末，溶于10 ml灭菌ddH2O中，0.22 μm无菌滤膜过滤，分装至1.5 ml离心管，-20 °C保存7.10× TE Buffer100 ml 1 mol/L的Tris-HCl (pH 8.0)，200 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)，加ddH2O定容至100 ml，121 °C，20 min，4 °C保存8.50% PEG2000称取50 g PEG2000粉末，溶于80 ml ddH2O，待粉末彻底溶解，定容至100 ml，121 °C，20 min，4 °C保存9.TE/LiAc Buffer1 ml 10× TE Buffer，1 ml 1 mol/L LiAc，加ddH2O定容至10 ml，4 °C保存10.40% PEG200010×TE Buffer和1 mol/L LiAc各1 ml与8 ml 50%的PEG2000混合均匀，4 °C保存11.10× D称取20.0 g D-葡萄糖，加ddH2O溶解并定容至100 ml，121 °C，20 min，室温放置12.YNB缺陷培养基称取0.67 g YNB溶于90 ml ddH2O，121 °C，20 min加10 ml 10× D，1 ml 10 mg/ml Leu，4 °C保存在液体培养基中加入2.0%琼脂即为YNB固体缺陷培养基13.YNB-CAA培养基称取0.67 g YNB和0.5 g CAA，加ddH2O至90 ml，121 °C，20 min，4 °C保存14.YPD (yeast extract peptone dextrose)称取酵母膏0.5 g，蛋白胨1 g，加ddH2O至45 ml，121 °C，20 min加5 ml灭菌的10× D，4 °C保存15.10× Gal称取20.0 g D-半乳糖溶于100 ml ddH2O，121 °C，20 min，室温保存致谢国家重点研发计划重点专项子课题“农副产品利用与饲料资源开发技术集成与应用” (2018YFD0501903)参考文献1. Wang, J. K. He, B. Du, W. et al. (2015). Yeast with surface displayed xylanase as a new dual purpose delivery vehicle of xylanase and yeast. Anim Feed Sci Technol, 208: 44-52.2.Boder, E. T. and Wittrup, K. D. (1997). Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol 15(6): 553-557.