设计P450驱动的塑料降解合成细菌

全世界每年生产350-400亿吨的塑料制品,其中大约80%的塑料使用后被堆积在垃圾填埋场或丢弃到环境中。这些塑料垃圾不仅占用土地资源、污染环境,还威胁着动植物及人类的健康与安全。通过各种生物催化剂(包括酶和微生物)的组合进行生物塑料降解,是解决塑料污染问题的一种绿色环保可持续的方法。近期韩国全南大学Soo-JinYeom等人在Trends in Biotechnology上发表《P450-driven plastic-degrading synthetic bacteria》一文,阐述了利用P450酶降解PE的合成细菌的设计原理,为利用合成生物学解决塑料污染问题提供了思路。

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塑料的降解需要生物催化剂 

最常见的塑料形式有聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯 (PVC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚氨酯 (PU) 和聚苯乙烯(PS)等。其中PE的降解是塑料降解中的重点和难点。PE是惰性材料,主链完全由C-C单键构成,不含任何官能团,因此难以降解。PE主要包含伯碳和仲碳的C-H键,另外还有少量的叔碳C-H键,他们的解离能分别为101.1kcal/mol,98.6kcal/mol和96.5kcal/mol。这意味着与其他位置相比,末端 (ω) 位置的C-H羟基化在热力学上是不利的。

在PE的有氧生物降解过程中,理论上需要羟化酶来催化PE中的C-H键形成羟基。已知只有AlkB烷烃羟化酶可以降解PE。在大肠杆菌中表达来自假单胞菌属的重组AlkB可将19%的低分子量PE(分子量为1700–23700)转化为CO2。AlkB家族烷烃羟化酶可以通过末端或次末端 (ω-1) 羟基化降解直链烷烃,分别生成1-烷醇或2-烷醇。1-烷醇和2-烷醇进一步被几种酶氧化为烷酸。

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P450具有降解PE的潜力

细胞色素P450(CYP,P450s)是一种潜在的PE降解羟化酶。P450是将一个氧原子引入有机底物分子的单加氧酶,属于血红素-硫醇蛋白超家族,广泛分布在从古细菌到人类的大多数生物体中。P450被认为是自然界中用途最广泛的生物催化剂,因为它们可以识别多种底物并催化多种反应类型,例如C–H羟基化、C=C双键环氧化、杂原子氧化、O -、N - 和S-脱烷基化、芳族偶联和C-C键断裂等。P450可以催化复杂有机分子中惰性C-H键的选择性氧化,这使它成为制药和精细化学品生产中常用的生物催化剂。大多数P450需要NAD(P)H驱动,少数可使用H2O2、过氧化叔丁基、氢过氧化枯烯等作为氧供体。

不同的P450羟基化PE的短降解中间体(即不同链长的直链烷烃、醇和脂肪酸)时具有不同位置的偏好,分为末端、次末端和链内羟基化。CYP102A1和CYP102A3对中链脂肪酸(C12-C18)的羟基化活性高;CYP505E3催化正烷烃 (C10–C16)、脂肪酸 (C12–C16) 甚至脂肪醇 (C10–C14) 的羟基化反应;CYP505D6催化脂肪醇和脂肪酸 (C9-C18) 羟基化;CYP52A3和CYP52A4催化烷烃和脂肪酸(C12-C18)的羟基化;CYP505A30对脂肪酸 (C14、C15)表现出较高的羟基化活性。

图1. P450的几种催化方式

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通过生物催化剂进行PE分解的假想机制 

PE主要包括具有少量支链的长直链烷烃。已经有文献报道了几种烷烃氧化机制,包括末端氧化、次末端氧化、双末端氧化和通过酶促反应产生脂肪酸的Finnerty途径。在之前的研究中已经发现了一些来自细菌、真菌甚至哺乳动物的P450可催化烷烃末端羟基化。基于此可提出正烷烃的末端氧化降解途径。首先通过羟化酶(例如AlkB或P450)在末端ω碳处进行羟基化,然后通过伯醇脱氢酶 (Adh) 形成相应的酮。最后,转化为羧基以产生链烷酸。

还有一些P450可以在次末端ω-1碳上区域选择性地羟基化以制备2-烷醇,可用于进行正烷烃的次末端氧化降解。在P450催化形成2-烷醇后,Adh催化形成相应的酮。在这个过程中,一个氧原子进入链中,通过Baeyer–Villiger单加氧酶(BVMO)形成酯基,最后酯酶裂解酯键生成烷醇和乙酸。链烷醇也可以转化为相应的链烷酸。

对于链内羟基化, P450、Adh、醛脱氢酶 (Aldh)、BVMO和酯酶的级联酶促反应产生两种类型的最终产物:链烷醇和链烷酸。链烷醇可以进一步氧化成醛,最后氧化成链烷酸。总之,通过级联酶促反应,PE被降解成脂肪酸(链烷酸,包括乙酸)。由于这些产物是分解代谢和合成代谢途径中的中间代谢物,因此它们可通过β-氧化途径和三羧酸循环为生物体制造供能或合成其他物质。

图2. 通过末端、次末端和链内羟基化降解线性正构烷烃的途径

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P450比AlkB更适用于PE的降解 

P450比AlkB更适用于构建降解PE的合成细菌,也更易进行酶工程改造。大多数细菌来源的P450可以在重组细胞中进行功能性表达,也可以用于构建合成细菌降解PE。而AlkB是一种膜蛋白,而且需要氧化还原伴侣(即红氧还蛋白和红氧还蛋白还原酶)辅助才能发挥功能,这种复杂性成为酶工程改造和应用于合成细菌的一大障碍。

当然P450也存在一些问题,例如聚合物不容易进入降解酶的活性位点。典型的P450活性位点很窄,通常通过孔洞与溶剂连接,这种形式不容易被高分子聚合物接触。在聚合物降解中,裂解纤维素的多糖单加氧酶 (LPMO) 和PET生物降解中的PETase在酶表面具有开放且相对平坦的活性位点,可以很容易地跟大型底物接触。降解PE的P450或其他加氧酶也应具有这种开放和平坦的活性位点,以供塑料聚合物进入进行链内羟基化。先前对可能进入结合位点的P450晶体结构的计算机分析已经系统地预测了一个孔洞网络,该网络将藏于深处的催化位点连接到蛋白质远端表面。这些技术可以帮助发掘可以在活性位点结合PE的新型P450,或者通过合成生物学工具包设计改造现有的P450。

理想的P450应具有聚合物可接近的活性位点;具有链内羟基化活性;对长链烷烃中的任何碳都具有高羟基化活性;具有由H2O2支持的过氧化酶活性,不需要氧化还原伴侣或高成本的辅助因子。这一在细菌表面具有工程化活性位点的假设P450酶可能是塑料降解的最佳生物催化剂。

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P450改进和PE降解合成细菌的生物技术方法

通过代谢工程和合成生物学人工设计的微生物细胞工厂可用于生产非天然化学品,这主要依赖定向进化、途径从头设计和酶工程技术。通过功能设计的级联酶促反应构建合成细菌来利用较难利用的营养物质的研究还比较少,但已展现出强大的生物改造潜力。例如,大肠杆菌通常不能使用甲醇作为唯一的碳源,但通过应用新的酶,如甲醇脱氢酶和C-C键合酶,并重新设计大肠杆菌的代谢途径,细胞同化甲醇的能力显著提高。塑料也是一种普通细菌不容易利用的碳源。通过将设计的合成途径与关键酶(如P450、Adh、BVMO和酯酶或其他必要的酶)应用到基因工程细菌(如大肠杆菌、假单胞菌或罗尔斯通菌等)中,有望构建可利用PE为唯一碳源生长的合成细菌。

图3. 具有假设的羟化酶、醇脱氢酶 (Adh)、Baeyer-Villiger单加氧酶 (BVMO) 和酯酶的假设PE降解合成细菌示意图

这一设想还存在诸多挑战。聚合物生物降解的一般过程可分为四个步骤:生物降解、生物破碎、同化和矿化。第一步从微生物的初始附着开始。这一步面临的困难是PE塑料的可及性。由于PE具有高表面疏水性,羟化酶难以附着在PE的表面。生物膜对于增加聚合物与细菌的表面相互作用是必不可少的,微生物分泌的胞外多糖为塑料表面提供强大的生物膜粘附力。另外,细菌的摄取能力存在大小限制(~500Da),高分子聚合物难以摄取到胞内,这种限制可以通过在细菌表面展示目标降解酶以直接结合PE来克服。接下来,生物膜中的微生物分泌细胞外酶,催化聚合物链解聚成低聚物、二聚体或单体。此处存在的问题是合成细胞是否具有大量分泌蛋白的能力。鞭毛中的异源酶表达系统可以考虑用于PE降解细菌以解决这一问题。在生物碎片化过程中产生的低分子量化合物在同化和矿化阶段被转运到微生物的细胞质中,最终生成CO2、CH4、H2O和N2等产物并释放到环境中。

最大的挑战是发掘可以将PE高效降解为短链烷烃的酶。通过酶工程改在提升酶的活性及稳定性已成为研究的热点。怎样快速从大量的突变体中筛选出优秀的个体是面临的另一个难题。基于转录因子 (TF) 的遗传生物传感器具有高灵敏度和配体特异性,在新型酶的高通量筛选 (HTS) 中逐渐受到关注。PE的水解产物是长链链烷酸(脂肪酸)。AlkX是一种来自 Dietzia sp.的正烷烃代谢中的alkB型烷烃羟化酶-红氧还蛋白融合基因,编码一种长链脂肪酸 (C10-C24)的转录调控因子,可用于构建检测PE单体的生物传感器。在微生物或酶对PE进行生物降解的过程中,必须释放PE单体,例如脂肪酸或烷烃,然后基于TF的生物传感器可以监测PE单体并转化成可量化的信号比如荧光强度。这种利用生物传感器的HTS将加快寻找新型羟化酶(如P450或AlkB)或改进现有羟化酶的速度,以提高酶在PE生物降解中的活性和稳定性,最终达到解决塑料污染的目的。

图4.基于合成生物学的遗传生物传感器在筛选PE降解酶中的应用原理

供稿:郑义

编辑:张彤 徐娅 李晓萌

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