如何提取组织DNA模板？

鉴定基因编辑鼠剪爪、剪尾组织量是多少？

根据实验经验，剪爪、剪尾应在出生后 7—12 天内完成，这样一方面既可避免母鼠吃仔，另一方面该时段的大小鼠容易抓取、出血较少，提取的基因组质量较高。

1.鼠尾尾尖（<5mm）可获得足够量DNA用于基因型鉴定。

2.AAALAC要求断趾法，最好用于小于7日龄的新生鼠，断趾操作剪取的鼠爪量为鼠爪趾尖组织1-2mm。

如何提取组织DNA模板？

方法一:

使用 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit (Ver.5.0_Code No. 9765) 来提取鼠尾基因组DNA。

准备工作：

1.备好无水乙醇。

2.WB使用前需要加入65mL的无水乙醇（试剂盒推荐56mL，我们经过长期数据显示，加入65mL提取的基因组纯度更高）。

3.Buffer GL若出现沉淀，请于56℃加热溶解，待恢复至室温后使用。

4.洗脱膜上的DNA时，用0.25X TE buffer洗脱的DNA保存时间更持久；使用前放置56℃预热，DNA洗脱效率更高。

实验流程：

1.每个装有样品的EP管中加 180μL Buffer GL, 20μL 蛋白酶K（用试剂盒里的蛋白酶K加20μL 即可，该浓度是20mg/mL），10μL RNA酶。（注意：鼠尾不能太长，一般2~5mm；如果鼠尾实在过粗，可以增大裂解体系至300μL）。

2.放置56℃ 烘箱过夜反应（一般12~16个小时）。

3.第二天早上从烘箱取出样品放置离心机里，12000rpm离心2分钟，将毛发杂质离到管底。

4.吸取上清至另一干净的EP管中（注意尽量不要吸到管底的毛发和杂质），再加入200μL Buffer GB 和 200μL的无水乙醇，盖好盖子后上下颠倒混匀。

5.混匀后将液体转移至准备好的吸附柱中，12000rpm离心2分钟；弃滤液。

6.向吸附柱中加入500μL Buffer WA，12000rpm离心1分钟；弃滤液。

7.吸附柱的管壁四周加入700μL Buffer WB ，静置1分钟，再12000rpm离心1分钟；弃滤液；（注意：一定要保证WB中已经加过了指定体积的无水乙醇；沿着吸附柱管壁四周加入WB，有助于完全冲洗沾附管壁上的盐份。）

8.重复操作步骤7，弃滤液.

9.空甩： 12000rpm 离心2分钟。

10.将吸附柱放置在一个新的1.5mL的离心管上，盖子开着，室温放置10分钟，以去除残留的乙醇；（注意：乙醇残留会抑制聚合酶扩增）。

11.向吸附柱膜的中央加入50μL 预热过的0.25X TE buffer，盖好盖子后室温静置10分钟；（注意：预热的灭菌水可以提高洗脱效率）。

12.12000rpm 离心2分钟洗脱DNA；可以将离下的液体再次加入膜中央，再静置5分钟，再12000rpm 离心2分钟，获得浓度更高的DNA。

13.将获得DNA测浓度，也可以通过电泳观察纯度。

方法二:

使用粗裂的方法获得鼠尾基因组DNA（适用于扩增＜1kb的条带）。

Triton裂解液的配制：（1L量）

1）分别用电子天平称取下列物品至烧杯：

KCl：3.7g

Tris：1.2g

2）加入300~400mL灭菌水溶解。

3）加入1mL TritonX-100，充分溶解，若不能充分溶解可以放入56℃烘箱中溶解。（TritonX-100呈油状液体，注意吸取前先润洗移液器，注意打尽TritonX-100后才能把枪头伸到溶液中反复吹吸，否则很容易使得TritonX-100大量残留在枪头内壁上）。

4）加入80μL浓盐酸调pH至9.0。

5）然后用灭菌水定容至1L后，室温保存，待用。

注意：TritonX-100高压灭菌后会产生大量沉淀，请勿高压灭菌。

样品的裂解：

1）取鼠尾或者鼠爪（~2mm）至EP管，加入98μL裂解液+2μL 20mg/mL的蛋白酶K（注：鼠尾不可超过3mm，不然裂解不充分，若鼠尾过粗，可以适量增加裂解液的量；蛋白酶K需要注意不要反复冻融，不然会影响活性）。

2）加了裂解液和蛋白酶K后，将EP管放入56℃烘箱或者水浴锅，过夜运行；

第二天从烘箱中取出样品，放置金属浴或者PCR仪中，98℃反应15分钟，目的是使蛋白酶K失活。

3）之后将样品离心15分钟，上清即可作为PCR模板。（一般25μL的PCR体系中，可以加入1.5μL的上清）。