【2018-52期】This Week in Extracellular Vesicles / 开普饭

Hzangs出国游玩去了，在最新文献中精选了9篇，委托企鹅给大家带来这周的周总结。第1篇报道了内皮细胞外泌体WNT5A分泌减少通过Wnt/PCP途径诱导肺动脉高压，揭示了Wnt5a在远端血管中建立PMVEC和周皮细胞相互作用的关键作用，提供了PMVEC外泌体Wnt5a的新机制；第2篇报道了动脉粥样硬化促进功能性miRNA-92a-3p包装进内皮微泡，丰富了EV-miR转移的分子机制，且具有作为CAD的新型生物标志物的潜力；第3篇是南方医大梁莉组的最新文章，主要是关于外泌体促进转移前生态位形成；第4篇介绍了组织内可视化检测外泌体的新方法；第6篇比较有意思，颠覆了我们之前的认知，沉淀法提取外泌体不仅有蛋白污染，同时也有非囊泡的RNA污染。相关文章的原文在周一前会发布到论坛同名贴下，需要的可以到论坛下载。

1. Yuan, K., et al. (2018). "Loss of Endothelial Derived WNT5A is Associated with Reduced Pericyte Recruitment andSmall Vessel Loss in Pulmonary Arterial Hypertension." Circulation. IF=18.88

Circulation：内皮细胞外泌体WNT5A的缺失与肺动脉高血压中周皮细胞募集减少和小血管损失相关

背景：肺动脉高压（PAH）是一种危及生命的肺循环障碍，与微血管的再生损失和受损有关。肺微血管的周皮细胞覆盖率降低是PAH的病理特征，部分原因是周细胞不能响应来自邻近肺微血管内皮细胞（PMVEC）的信号提示。斯坦福大学先前的研究已经表明，周皮细胞募集需要激活Wnt/PCP途径，但PMVEC产生和释放特异性Wnt配体是否是造成周皮细胞中Wnt/PCP活化的原因尚不清楚。

方法：使用3G5或CD31抗体缀合的磁珠从健康供体和PAH肺中分离周皮细胞和PMVEC。使用Wnt引物文库通过qPCR记录PMVEC的Wnt表达谱。使用ExoTIC装置从PMVEC培养基中进行外泌体纯化。在常氧、慢性缺氧和缺氧恢复的条件性内皮特异性Wnt5a敲除（Wnt5a（ECKO））小鼠模型中获得血流动力学曲线、右室功能和肺血管形态测定。

结果：与周皮细胞共培养的健康PMVEC中Wnt配体表达的定量表明Wnt5a（一种已知的Wnt/PCP配体）增加了35倍。在PAHPMVEC中未观察到这种Wnt5a峰值，这与在基质胶共培养测定中不能募集周皮细胞相关。从培养基中纯化的外泌体显示，当健康PMVEC与周皮细胞共培养时Wnt5a含量增加，这一发现在PAH PMVEC的外泌体中未观察到。此外，在共培养研究中，添加重组Wnt5a或纯化的健康PMVEC外泌体增加了PAH PMVEC的周皮细胞募集。虽然在常氧和慢性缺氧方面没有差异，但Wnt5a（ECKO）小鼠在慢性缺氧恢复后4周表现出持续性肺动脉高压和右室衰竭，这与微血管的显著减少，肌肉化和周皮细胞覆盖减少相关。结论：该研究将Wnt5a鉴定为建立肺内皮-周皮细胞相互作用的关键介质，其损失可能通过降低新形成血管的活力而导致PAH。该报道推测模仿或恢复Wnt5a产生的疗法可以帮助防止PAH中小血管的丢失。

小编按：该研究发现PAH患者分离的肺微血管内皮细胞（PMVEC）和来自PAH组织的内皮小编Wnt5a表达降低。健康的PMVEC通过外泌体递送Wnt5a，调节周皮细胞的募集、运动和极性。内皮细胞缺乏Wnt5a的慢性缺氧小鼠表现为持续性肺动脉高压、右室衰竭和复氧后周皮细胞覆盖率降低。该研究揭示了Wnt5a在远端血管中建立PMVEC和周皮细胞相互作用的关键作用。提供了PMVEC外泌体Wnt5a的新机制。在临床应用上具有潜在价值。

2. Liu, Y., et al. (2018)."Atherosclerotic Conditions Promote the Packaging of Functional MicroRNA-92a-3p into Endothelial Microvesicles." Circ Res. IF=15.211

Circ Res：动脉粥样硬化促进功能性miRNA-92a-3p包装进内皮微泡

理论依据：微囊泡（MV）中的微小RNA（miRs）是心血管疾病的生物标志物和效应物。MV-miR表达是否在冠状动脉疾病（CAD）中受到调节尚不清楚。目的：该报道探讨循环MV-miRs在CAD患者中的表达，并研究MV-miR在内皮细胞中的作用。方法和结果：通过超速离心从患者血浆中分离循环MV。电子显微镜用于确定MV的大小。TaqmanmiR阵列显示，与ACS患者相比，稳定性CAD患者中某些MV-miRs受到显著调节。为了验证miR阵列结果，对180名血管造影，排除CAD（n=41），稳定性CAD（n=77）和急性冠状动脉综合征（ACS，n=62）的患者进行了前瞻性研究。9种参与血管性能调节的miRs——miR-126-3p，miR-222-3p，miR-let-7d-5p，miR-21-5p，miR-26a-5p，miR-92a-3p，miR-139-5p，miR-30b-5p和miR-199a-5p——通过实时PCR在循环MVs中定量。其中，与非CAD患者相比，CAD患者的miR-92a-3p显著增加。MV分选实验显示内皮细胞（EC）是含有miR-92a-3p的MVs的主要细胞来源。体外oxLDL和IL-6刺激增加了亲本ECs中miR-92a-3p的表达，并上调了内皮微泡（EMV）中miR-92a-3p的水平。miR-92a-3p和EMV的标记证明功能性miR-92a-3p被转运到受体ECs中，加速了细胞迁移和增殖。在EMV中敲除miR-92a-3p消除了EMVs介导的对基质胶栓中ECs迁移、增殖的影响，并阻断了血管网络形成。基于PCR的基因谱分析显示，EMVs在ECs中显著降低THBS1蛋白（miR-92a-3p的靶标和血管生成抑制剂）的表达。在EMVs中敲除miR-92a-3p消除了EMVs介导的对THBS1基因和蛋白质表达的抑制。结论：动脉粥样硬化病症促进内皮miR-92a-3p包装进EMVs。EMVs介导的功能性miR-92a-3p的转移通过THBS1依赖性机制调节受体ECs的血管生成。

前期详细报道：Circ Res：动脉粥样硬化促进功能性miRNA-92a-3p包装进内皮微泡

小编按：动脉粥样硬化与外泌体/微泡的研究还是有不少报道的，感兴趣的小伙伴可以上外泌体资讯网上用关键词检索一下看看。多项研究已经证明，循环miR的组织表达和血浆水平在几种心血管病理学中被改变。由于存在于细胞外囊泡中，miR在流体中显示出高稳定性并且在血液中可靠地检测到。因此，循环miR显示出作为CAD的新型生物标志物的潜力。尽管它们在心血管生物学中发挥着重要作用，但EV-miR转移的分子机制对于调节受体细胞生物学的知识却很少。该研究显示microRNA-92a-3p通过EV转移到受体内皮细胞，以STAT3-THBS1依赖性方式促进血管生成反应。

3. Zeng, Z., et al. (2018)."Cancer-derived exosomal miR-25-3p promotes pre-metastatic niche formation by inducing vascular permeability and angiogenesis." Nat Commun 9(1):5395.IF=12.353

【Nat Commun】南方医大梁莉组：癌症外泌体miR-25-3p诱导血管通透性和血管生成促进转移前生态位形成

癌症来源的外泌体被认为是癌症诱导的转移前生态位形成的主要驱动因素，但其机制尚不清楚。该研究显示miR-25-3p，一种促进结直肠癌（CRC）转移的促进miRNA，可以通过外泌体从CRC细胞转移到内皮细胞。外泌体miR-25-3p通过靶向KLF2和KLF4调节VEGFR2、ZO-1、occludin和Claudin5在内皮细胞中的表达，从而促进血管通透性和血管生成。此外，来自CRC细胞的外泌体miR-25-3p显著诱导血管渗漏并增强小鼠肝和肺中的CRC转移。此外，CRC转移患者中来自循环外泌体的miR-25-3p的表达水平显著高于无转移的患者。该研究表明，外泌体miR-25-3p参与转移前的生态位形成，可用作CRC转移的基于血液的生物标志物。

前期详细报道：【Nature子刊】南方医大梁莉组：癌症外泌体miR-25-3p诱导血管通透性和血管生成促进转移前生态位形成

小编按：外泌体促进转移前生态位形成的研究之前也有报道，比如，大牛Lyden的一篇报道（Nat Cell Biol, 2015）发现发现胰腺导管腺癌 (PDACs)来源的外泌体诱导肝脏中转移前微环境的形成，从而增加了肝脏转移性负担。曹雪涛研究团队发现（Cancer Cell, 2016），肺上皮细胞是中性粒细胞募集和肺转移利基形成的关键位置，通过肿瘤外泌体RNA和Toll样受体3（TLR3）实现。这篇报道从血管通透性的角度进一步解析了外泌体如何促进转移前生态位形成。

4. Sun, Y., et al. (2018)."Intraoperative visualization of the tumor microenvironment and quantification of extracellular vesicles by label-free nonlinear imaging."Sci Adv 4(12): eaau5603. IF=11.511

Sci Adv：通过无标记非线性成像术可视化肿瘤微环境和定量细胞外囊泡

肿瘤微环境的表征，包括细胞外囊泡（EV），对于理解癌症进展是重要的。传统上，EV研究是在解离的细胞上进行的，缺乏空间信息。由于肿瘤微环境中EV的分布与细胞功能相关，因此强烈需要在新切除的组织中可视化EV。该研究使用定制的非线性成像系统对未经治疗的人乳房组织进行术中成像。与组织学发现相关，无标记光学对比使得肿瘤微环境的程序点表征成为可能。发现29例乳腺癌患者的EV密度随着组织学分级越来越高，肿瘤边缘距离越来越短而增加，并且显著高于7例接受乳房缩小手术的无癌患者。这些术中图像的获取和解释不仅提供了肿瘤微环境的实时可视化，而且还提供了将EV用作癌症诊断和预后的无标记生物标志物的潜力。

小编按：该研究发现较为新颖，通过无标记的方式可视化肿瘤组织中的细胞外囊泡，在癌症诊断和预后的临床应用上具有较高的应用前景。

5. Freeman, D. W., et al. (2018)."Altered Extracellular Vesicle Concentration, Cargo, and Function in Diabetes." Diabetes 67(11): 2377-2388. IF=7.273

Diabetes：糖尿病改变了循环细胞外囊泡的浓度、内容物和功能

前期详细报道：Diabetes：糖尿病改变了循环细胞外囊泡的浓度、内容物和功能

小编按：该研究发现糖尿病改变了循环细胞外囊泡的分泌，并会影响免疫细胞的功能。关于糖尿病与细胞外囊泡之间的研究先前也有报道，做这方面的小伙伴上外泌体资讯网检索一下就能找到很多。小编在一些会议的摘要中也发现了些重要的研究，相信后续还会有些这方面正式刊物的重要报道。

6. Karttunen, J., et al. (2019)."Precipitation-based extracellular vesicle isolation from rat plasmaco-precipitate vesicle-free microRNAs." J Extracell Vesicles 8(1):1555410.

J Extracell Vesicles：基于沉淀法从大鼠血浆中分离的细胞外囊泡中含有非囊泡的微小RNA

血浆细胞外囊泡（EV）中含有的miRNA作为脑部疾病的生物标记，可以非侵入性地获得，但目前的探索还相对较少。从血浆中分离EV的方法仍然在摸索中。对于EV的分离，重要的是确保去除无囊泡的miRNA，其占血浆miRNA的约三分之二。基于膜颗粒沉淀的EV分离是一种有吸引力的方法，因为它具有简单的方案和高产率。该报道评估了基于沉淀的方法的性能，以从少量大鼠血浆中获得富集的EV特异性miRNA。研究对沉淀分离的EV颗粒和全血浆进行了尺寸排阻色谱（SEC）。使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）、蛋白质和miRNA浓度测定以及针对四种miRNA（miR-142-3p，miR-124-3p，miR-23a，miR-122）的液滴数字聚合酶链反应分析SEC级分。还用透射电子显微镜（TEM）分析沉淀分离的EV和来自血浆的所选SEC级分。基于沉淀的EV分离共沉淀9％至15％的血浆蛋白和21％至99％的无囊泡miRNA，这取决于各个miRNA。此外，主要在EV级分中发现的miR-142-3p的量在EV级分中降低，表明其部分在基于沉淀的分离期间丢失。Western blot和TEM显示沉淀分离的EV-颗粒中的蛋白质和脂蛋白污染。研究结果表明，基于沉淀的方法不足以纯化含有血浆EV的miRNAs。通过NTA测量的颗粒数量很高，但这主要是由于污染的脂蛋白。尽管去除了无囊泡miRNA的一部分，但是通过基于沉淀的方法分离的血浆EV颗粒中仍然含有大量的非囊泡miRNA。

小编按：我们都是知道，沉淀法提取的外泌体时有大量的杂蛋白的污染，尤其是脂蛋白等。我们一直以为只是有杂蛋白的污染，在做RNA实验时不受影响。但是，这篇文章更新了我们的认识。用沉淀法提取外泌体时，不仅有杂蛋白的污染，同时也有非囊泡RNA的污染！在仅有有限样品体积的情况下，例如当在少量大鼠尾静脉血浆中分析EV相关生物标志物时，基于沉淀的EV分离确实是很吸引人的。然而，如此文所证明的，沉淀的EV级分还含有脂蛋白和非囊泡的miRNA。因此，从小样本量中简便高效提取EV的方法仍有待进一步开发。

7. Li, W., et al. (2018). "Emerging Nanotechnologies for Liquid Biopsy: The Detection of Circulating Tumor Cells and Extracellular Vesicles." Adv Mater: e1805344. IF=21.95

Adv Mater：液体活检的新兴纳米技术——循环肿瘤细胞和细胞外囊泡的检测

小编按：这篇综述总结了纳米材料、纳米结构、纳米器件和用于液体活检的纳米传感器的最新进展，重点介绍了循环肿瘤细胞（CTC）和细胞外囊泡（EV）的检测和分子表征。讨论了纳米材料和纳米结构在提高CTC和EV检测的灵敏度、特异性和纯度方面的发展和进展。对液体活检/CTC/EV感兴趣的小伙伴可以关注一下。

8. Liu, C., et al. (2018). "Lipid Nanovesicles by Microfluidics: Manipulation, Synthesis, and Drug Delivery." Adv Mater: e1804788. IF=21.95

【Adv Mater】国家纳米中心孙佳姝课题组：基于微流控的脂质纳米囊泡的控制、合成及药物递送应用

前期详细报道：国家纳米中心孙佳姝课题组AdvancedMaterials杂志综述：基于微流控的脂质纳米囊泡的控制、合成及药物递送应用

小编按：这是国家纳米中心成立15年献礼的综述，对微流控和脂质纳米囊泡研究感兴趣的小伙伴可以研读一下。

9. Morgan, C. P., et al. (2019)."Driving the Next Generation: Paternal Lifetime Experiences Transmitted via Extracellular Vesicles and Their Small RNA Cargo." Biol Psychiatry85(2): 164-171. IF=11.982

Biol Psychiatry：父亲生活经历的影响通过细胞外囊泡及其小RNA的传递影响后代

小编按：该综述涉及父系细胞外囊泡本身可作为载体的可能性，不仅向配子或受精卵传递信号，而且还向母体生殖道的组织传递信号以影响胎儿发育。关注生殖相关细胞外囊泡研究的可以看看。

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