CRISPER-Cas9技术服务周期及流程

一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。细菌利用该系统可抵御噬菌体入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。具有成本低廉，操作方便，效率高等优点。其基本作用原理为：当噬菌体病毒首次入侵宿主细菌，病毒的双链DNA被注入细胞内部。CRISPR/Cas系统会从这段外源DNA中截取一段序列作为外源DNA的“身份证”，然后将其作为新的间隔序列被整合到基因组的CRISPR序列之中。因此，这段与间隔序列对应的“身份证”被称为原间隔序列（protospacer），原间隔序列向两端延伸的几个碱基都十分保守，被称为原间隔序列临近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。Cas9 蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割与crRNA 杂交的DNA单链（类HNH蛋白功能区）和解旋的游离单链（类RuvC蛋白功能区）。Cas9 首先与crRNA 及 tracrRNA 结合成复合物，然后通过 PAM 序列结合并侵入 DNA，形成 RNA-DNA 复合结构，进而对目的DNA 双链进行切割，使 DNA 双链断裂。

流程：1.在把基因序列中寻找NGG序列获得其附近20多个碱基的系列，与tracrRNA序列融合，设计出sgRNA（small-guide RNA）并合成该序列。2.将该序列以及cas9基因连入载体。3.转化感受态，质粒小提，测序验证。4.细胞培养与转染。5.建立稳定的敲除细胞株。