一作解读| 突变TaGW7可以使麦粒变宽变短并增加千粒重

突变TaGW7可以使麦粒变宽变短并增加千粒重

题记：文章(Wang et al.,2019) online以后，我很犹豫要不要写这篇推送。原因主要是事情太多，要完成各种课题汇报，必须加紧做实验，时间实在是不够用。拗不过王瑞的劝说，我还是答应搞完课题汇报就写。既然是第一作者写推送，在介绍文章内容的同时我还是扯一点文章里没有的，做实验过程中的小插曲，用楷体字（由于手机端和电脑端显示不同，手机端为小号字体-小编注）与文章的主要内容区分开，方便没有兴趣的朋友跳过去。

2015年7月，Nature Genetics背靠背发表了通过QTL mapping克隆GW7/GL7，并解析其基因功能的两篇文章。一篇是傅向东老师实验室发表的(Wang et al., 2015a)，另一篇是李家洋老师实验室和钱前老师实验室合作发表的(Wang et al., 2015b)。之所以一个基因有两个名字，倒不是因为两个实验室分别给予了不同的名字，而是研究人员在分别研究控制粒宽和粒长的基因时，发现水稻7号染色体上存在着一个同时调控粒宽（Grain Width）和粒长（Grain Length）的基因座。我们在以下的叙述中使用GW7。两篇文章都表明，自然突变造成的GW7基因表达水平升高，可以使水稻种子变窄变长，同时降低大米的垩白度。长期以来，研究水稻的科研人员发现细长的大米往往外观品质比短而宽的大米更好。GW7基因的克隆，在基因水平上解释了这一现象。小麦和水稻一样，都是单子叶农作物，但是大米和麦粒在结构和成分上还是有很大的区别，所以非常值得进一步研究GW7基因在小麦中的同源基因是否有同样的功能。

我在之前的推送中介绍过我们的TaGW2基因突变体的文章（https://mp.weixin.qq.com/s/CmNM37Ir3kR86dunFLcnjA）。单就技术层面而言，TaGW7基因这篇文章突变体部分的工作可以说是之前TaGW2文章的翻版，没有太大意思。根据从USDA-NIFA申请funding时的计划，我们根据现有的小麦基因组参考序列，找到一些其它作物中控制产量构成因素基因在小麦中的同源基因。应用我们实验室以及合作者搭建好的CRISPR-Cas9在小麦中应用的平台，创制并筛选这些同源基因的突变体。如果突变某个基因可以正向改变产量构成因素，那么我们就会考虑继续往育种应用的方向推进。

Figure1，Thealigned NGS reads flanking the GW7T6 target site and their frequencies in T0line YLD2-5-1, and its T1 derivatives are shown. WT stands forwild-type alleles; “-” signs and numbers represent the number of bases deleted.The frequency of each mutation type is shown on the right. The PAM sequencesare underlined. The deleted nucleotides are shown with red dashed lines. Thegene homoeologs, which had edited alleles transmitted to the next generation oftransgenic plants are highlighted with red color.

利用CRISPR-Cas9创制小麦基因突变体需要做转基因，但做小麦转基因并不容易。要拿到足够多的转基因苗，需要投入大量的时间和精力。即便是拿到了阳性的转基因苗，由于CRISPR-Cas9本身在小麦中编辑效率并不够高，能拿到的突变体比例也还是比较低。为了节约劳动力成本，我们发展了利用转基因小麦中活跃的CRISPR-Cas9在高代（T1代及以后）的转基因苗中筛选突变体的方法(Wang et al., 2018a)。在拿到15株CRISPR-Cas9阳性的T0代转基因苗后，我们通过二代测序对CRISPR-Cas9的靶标位点进行了鉴定。发现有一株苗YLD2-5-1在A、B、D三个基因组上都带有少量突变（Figure 1），表明该植株携带的CRISPR-Cas9处于活跃状态。在该苗的70株T1代后代中，我们筛选到了两株在B、D基因组上带有杂合突变的植株。我们利用这两株T1代苗的后代进行表型鉴定。
在完成了两次小群体的表型鉴定后，基本上确定了TaGW7-B1和TaGW7-D1在小麦中负调控粒宽，正调控粒长。但是两次实验的数据中都存在某个基因型的植物数量不够的问题。第三次实验中我增加了各个基因型的植株数量。同时为了排除转基因过程中造成的遗传背景差异，我将两个不同T1代转基因苗的后代分开进行表型分析。Table 1 是其中一个群体的结果。第三次的实验结果表明，TaGW7-B1负调控小麦的粒宽，对粒长没有造成统计学意义上的显著影响；TaGW7-D1则负调控粒宽，正调控粒长；TaGW7-B1和TaGW7-D1有加性效应。当我看到千粒重的结果后，我对自己表示了一下怀疑。因为在两篇研究水稻的文章中，一篇文章表明提高GW7的表达可以增加千粒重(Wang et al., 2015b)，另一篇文章表明提高GW7的表达并不影响千粒重(Wang et al., 2015a)。所以，按照基因在小麦和水稻中功能具有保守性的原则来推测，突变TaGW7应该不会增加小麦的千粒重。再三重复检查实验结果之后，我们确认TaGW7-B1和TaGW7-D1双突变体的千粒重相对于野生型有显著提高（Λ_Λ）。目前我们认为可能是由于小麦相对于水稻具有一些特异信号通路参与调控种子的大小和重量，但其具体的差异原因还有待进一步研究。相对于TaGW7-B1，TaGW7-D1突变后麦粒的形状和重量变化更大（Table 1）。这种对表型贡献的差异，有可能是由于在幼穗中TaGW7-D1的表达水平高于TaGW7-B1。这与TaGW2基因一样，表达水平与突变后对表型的贡献率一致 (Wang et al., 2018b)。此外，我们还研究了突变体幼穗中TaGW7-A1，TaGW7-B1和TaGW7-D1的表达变化。和TaGW2基因突变后的情况一样，被突变的基因拷贝表达水平降低，但没有对其它的基因拷贝造成显著的影响。

在水稻中，GW7调控大米的垩白度，改变淀粉颗粒的结构。麦粒与大米有所不同，不能直接观察垩白度，所以我们尝试测量TaGW7-B1和TaGW7-D1单突变体和双突变体小麦中淀粉颗粒的大小。但由于经验不足，取样时没有控制好麦粒在穗子上的位置，得到结果在生物学重复之间差异太大，所以在文章中并没有展示这一部分工作。在后续的实验中我们会继续研究这一问题。

傅向东老师实验室的文章证明了SPL16，一个水稻产量的正调控蛋白，可以结合到GW7基因的启动子区域，负调控GW7基因的表达(Wang et al.,2015a)。为了研究这两个基因在小麦中是否有同样的调控关系，基于已经发表的小麦不同生长期的RNAseq数据(Ramirez-Gonzalez et al., 2018)，我们分析了TaSPL16和TaGW7的表达模式。但结果发现在TaSPL16表达量提高时，TaGW7的表达并没有相应地降低。

基于上述RNAseq数据，我们进一步分析了TaGW7基因的共表达基因，并对这些基因进行聚类。结果表明TaGW7基因与以下类型的基因共表达：参与维管运动、调控有丝分裂、转运生长素、调控生长发育和参与细胞壁合成的基因等等（Table 2）。为了验证共表达分析的结果，我通过在小麦原生质体中的荧光蛋白共定位实验，证明了TaGW7与微管蛋白的共定位。此外，傅向东老师实验室在水稻中的研究工作利用酵母双杂交找到了一些与GW7互作的蛋白(Wang et al., 2015a)。我们找到了这些基因的小麦同源基因，发现有接近一半的GW7互作蛋白的小麦同源基因出现在共表达基因中。

在整理实验结果的过程中，Dr. Akhunov问了我一个问题，目前在所有报道的QTL定位或者GWAS的研究中，有没有哪一个QTL是明确指向TaGW7基因的。通过查阅文献，我给出了否定的答案。由于想到在水稻中GW7基因的克隆是基于大米颗粒细长的品种和短而粗的品种杂交，我问了Dr. Akhunov一个问题，有没有哪些小麦品种的麦粒是特别细长的。他想了想，说他几乎从未见过细长的栽培品种，但是他知道几乎所有的野生二粒小麦（wild emmer）都有细长的麦粒。回答完我的问题，他变得非常激动，直接就去了贺飞的办公室，让贺飞从刚刚发表的外显子捕获的数据 (He et al., 2019) 中调出TaGW7基因的haplotype。然后他告诉我们，可以分析一下TaGW7基因的haplotype，看看是否在驯化的过程受到了选择。

通过haplotype分析，我们发现在A和B基因组，在栽培品种、地方品种和驯化二粒小麦中出现频率最高的haplotype（H1a和H1b），在野生二粒小麦中的出现频率反而偏低（Table3）。H1a在栽培品种、地方品种和驯化二粒小麦中出现的频率分别是84.3%，85%和100%，而在野生二粒小麦中的出现频率只有19.4%。在野生二粒小麦中出现频率为45.2%的H5a和35.5%的H6a，在栽培品种、地方品种和驯化二粒小麦中的出现频率则非常低（1.2%）或者就没有出现。在B基因组上，GW7基因有两种主要的haplotype，H1b和H2b。H1b在栽培品种、地方品种和驯化二粒小麦中的出现频率分别为57.3%、70.9%和70%，但在野生二粒小麦中出现的频率仅为13.3%。H2b在栽培品种、地方品种和驯化二粒小麦中的出现频率分别为38.4%、26.5%和30%，但在野生二粒小麦中出现的频率却高达86.7%。TaGW7-D1有两种haplotype，H1d和H2d，但H1d在在栽培品种和地方品种中出现的频率都超过99%。

除了haplotype分析，我们还分析了染色体2A和2B在普通小麦、驯化和野生二粒小麦三者之间的群体分化关系以及各个群体内部的遗传多样性（Figure2）。结果表明野生二粒小麦中的TtGW7-A1基因正好落在驯化选择清除区域（domestication selective sweep region）。同时，在该位点附近，驯化二粒小麦和普通小麦中的遗传多样性（p）降低，野生和驯化二粒小麦之间的遗传分化（FST）增强。但是在TtGW7-B1基因附近虽然没有出现明显的选择性清除，但是能够观察到野生和驯化二粒小麦之间的遗传分化（FST）有所增强。

Figure2. Patterns of genetic diversity anddifferentiation on chromosomes 2A and 2B. Selective sweeps on chromosomes2A and 2B associated with wheat domestication were identified using the XP-CLRscans performed using wild emmer (WE) as reference population and domesticatedemmer (DE) as target population. Average pair-wise genetic differentiation (FST) and average pair-wisediversity per SNP site (p)in the corresponding regions in the populations of wheat, wild and domesticatedemmer was estimated using SNPs in 2-Mb sliding windows. FST was measured between wild and domesticated emmer (FST (WE-DE)) and between wildemmer and wheat (FST(WE-Wheat)).The positions of the GW7 geneorthologs are shown by the vertical dashed red lines.

证明TaGW7基因在小麦中调控麦粒的形状是这部分研究工作的主要内容。但通过上述研究工作，我们还有以下几点推测。1）小麦和水稻中的基因在功能上具有高度的保守性，但也可能存在一些物种特异的调控通路，导致少数基因在某些表现型上的不同。2）每个基因在三个亚基因组上的拷贝对表型的贡献率与它们的表达水平一致。这一点在TaGW2和TaGW7基因的功能研究中都有明确体现。3）TaGW7通过对微管蛋白或微管结构的调控，进而影响一些包括细胞分裂和细胞形态的信号通路，对麦粒的形状和大小进行调控。4）TaGW7基因在小麦的驯化过程中很可能受到了选择。

故事分享完了。为了赶进度，在已经发表的研究中依然有许多不足之处，比如关于千粒重表型鉴定最好还有更多的重复实验，TaGW7-A1突变后会有什么样的表型……此外，对于功能重要的基因，如果有能力深度挖掘下去的话，总会有很多好的故事在等着我们。首先，虽然人们对TaGW7基因在拟南芥和水稻中的同源基因都已经有了较为深入的研究，但是大家对它们是如何调控微管运动的并不完全清楚。其次，我们虽然提出TaGW7基因在小麦的驯化过程中很可能受到了选择，但是仍然需要大量工作来进一步正其是否是真正的驯化基因。我们在后续的工作中会继续深入研究这些问题，希望能够尽快和大家分享。也诚心地欢迎各位不吝赐教，更多地与我们交流合作。

最后特别致谢我的导（老）师（板）（Λ_Λ）在整个研究过程中的帮助和支持；感谢我们实验室的研究生潘千里完成了TaGW7基因CRISPR-Cas9靶标的设计和验证工作；感谢合作者田斌（Dr.）和他的老板（Dr. Harold N. Trick）完成了小麦转基因的工作；非常感谢贺飞（如果你不知道他，可以看小麦研究联盟的这篇推送：Nature Genetics 一作解读| 野生麦类近缘物种基因渗入主导的小麦适应性进化）完成了基因共表达分析和进化分析。也正是机缘巧合，贺飞刚好完成了野生近源物种对小麦适应性进化分析，我们才有了对TaGW7基因进行haplotype以及进化分析的可能性。最后致谢我们的funding支持者USDA-NIFA和Kansas wheat commission对我们研究工作的大力支持。

参考文献

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Ramirez-Gonzalez, R.H.,Borrill, P., Lang, D., Harrington, S.A., Brinton, J., Venturini, L., Davey, M.,Jacobs, J., van Ex, F., Pasha, A., Khedikar, Y., Robinson, S.J., Cory, A.T.,Florio, T., Concia, L., Juery, C., Schoonbeek, H., Steuernagel, B., Xiang, D.,Ridout, C.J., Chalhoub, B., Mayer, K.F.X., Benhamed, M., Latrasse, D.,Bendahmane, A., International Wheat Genome Sequencing, C., Wulff, B.B.H.,Appels, R., Tiwari, V., Datla, R., Choulet, F., Pozniak, C.J., Provart, N.J.,Sharpe, A.G., Paux, E., Spannagl, M., Brautigam, A. and Uauy, C. (2018) The transcriptional landscape of polyploid wheat. Science, 361.

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