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Tumor immune microenvironment in cancer patients with leukocytosis白细胞增多肿瘤患者的肿瘤免疫微环境
一、研究背景
肿瘤相关白细胞（TRL）指肿瘤患者外周血中异常升高的白细胞。已有许多证据证明，密切联系于肿瘤微环境的TRL与更差的放化疗效果以及预后相关，但目前尚未有好的适用于TRL阳性患者的疗法。作者希望通过在本研究中对TRL的深入探索，为日后的临床实践提供一些参考。
二、研究思路
三、结果解析
1.TRL与差异表达基因及预后的关联
在本文中，TRL阳性指无感染指征但白细胞计数超过9000/μL。作者联系了4位TRL阳性和4位TRL阴性的宫颈鳞状细胞癌（CESC）患者取样进行了RNA测序，患者资料展示于表1。分析发现，相比于阴性患者，TRL阳性患者往往具有更高的年龄，更大的瘤体以及更晚的分期。此外，TRL阳性患者中性粒细胞的数量往往较多，而且粒淋比（NLR）更高。所有8名患者都接受过放化疗，而3名TLR阳性患者出现复发，4名阴性患者均未复发，在后续随访中，2名阳性患者去世，4名阴性患者全部存活。以上研究结果提示——TRL阳性患者与阴性患者除了白细胞计数之外，可能在还某些方面存在差异。
表1.TRL阳性和阴性病例的各项数据
为了进一步验证上述推论，作者对8名患者的RNA测序结果进行了分析。主成分分析（PCA）结果显示TRL阳性和阴性病人的肿瘤转录组之间有显著差异（图1a）。作者再进一步使用R包DESeq2筛选出了TRL阳性患者相对于阴性患者的591个差异表达基因（P<0.05，log2fold change>1），其中有227个基因表达显著升高，364个基因表达显著降低（图1b）。无监督层次聚类的结果也显示了TRL阳性和阴性患者的肿瘤基因signature有显著差异（图1c）。
图1a.PCA结果；图1b.差异表达基因分析结果；图1c.层次聚类结果
作者进一步研究发现，TRL阳性患者相比于阴性患者显著上调的基因有与肿瘤/睾丸抗原相关性比较密切的MAGEA1、MAGEA3、MAGEA6、MAGEC2、ACTL8，有中性粒细胞趋化因子基因CXCL3、CXCL8，炎性细胞因子基因IL1B，与上皮-间质转化相关的LOXL2、PFN2；相比于阴性患者显著下调的基因包括与T细胞相关的CD8A, CD8B，与T细胞免疫反应相关的HLA-E、IDO1，与补体通路相关的C7（图1b）。这些发现在某种程度上暗示了TLR阳性患者在抗肿瘤免疫反应和预后方面要差于阴性患者。
基因集富集分析（GSEA）结果显示TRL阴性肿瘤的基因富集于淋巴细胞介导的免疫过程、对IFN-γ的细胞应答以及T细胞活化过程，而TRL阳性肿瘤基因富集于DNA修复、复制和细胞周期进程（图1d）。因为放疗中的高能粒子流主要作用靶点是癌细胞的DNA，所以以上结果提示TRL阳性患者的肿瘤具有一定的辐射抗性，而在GSEA结果中也观测到了TRL阳性肿瘤的辐射抗性相关基因的富集（图1e）。
为了进一步验证上述结果，作者将TCGA数据库CESC患者数据纳入分析，因为数据中缺少血细胞计数这一项，所以作者利用基因集差异分析（GSVA）的结果计算得到每个病人的白血球增多signature（LS）评分来代替，具体方式是使用在TRL阳性患者相比于阴性患者显著上调的基因的GSVA得分减去显著下调的基因的GSVA得分。计算出每个病例的LS评分后，将LS的上四分位数作为阈值将患者分为高低LS组。作者再将辐射抗性相关基因与LS评分进行相关分析后发现高LS评分患者肿瘤表现出更高的辐射抗性（图1f），高低LS组之间的辐射抗性相关基因signature分数也有显著差异（图1g）。生存分析的结果也提示高LS组的患者预后显著差于低LS组（图1h）。值得注意的是，在未接受放射治疗的组中，高LS评分依然与更差的预后相关（图1i），暗示其不良预后可能还与更多因素相关。
图1d.TLR阳性和阴性肿瘤的GSEA结果；图1e.辐射抗性相关基因的富集情况；图1f.LS分数与辐射抗性基因表达的相关性；图1g.高低LS组辐射抗性基因表达的差异；图1h.全部CESC患者预后与高低LS组的关系；图1i.未接受放疗CESC患者预后与高低LS组的关系
2.LS与免疫微环境
在得到上述结果之后，作者又基于LS评分研究了TCGA CESC患者的肿瘤免疫微环境，发现LS评分与通过GSVA得到的单核/巨噬细胞活化signature评分和淋巴细胞浸润signature评分呈显著负相关，而与损伤修复因子signature评分呈显著正相关（图2a）。聚类分析也显示高LS组通常对应着较高的损伤修复signature评分以及较低的单核/巨噬细胞活化，IFN-γ response，TGF-β response，淋巴细胞浸润signature评分（图2b），然而，部分属于高LS组的样本具有高IFN-γ response，TGF-β response，淋巴细胞浸润signature评分，这预示着高LS组的肿瘤存在一定的异质性。
图2a.LS评分与免疫及损伤修复相关过程的联系
图2b.基于高低LS组与不同免疫及损伤修复相关过程的层次聚类
作者接下来研究了在负向调控免疫应答中起重要作用的髓系抑制性细胞（MDSC）在TRL阳性和阴性患者中的活化情况，发现抑制性的MDSC基因signature在TRL阳性肿瘤中显著富集（图2c），对TCGA的数据分析后也发现，抑制性的MDSC基因signature评分与LS评分呈显著正相关（图2d），相比于低LS组的肿瘤，高LS组肿瘤具有更高的MDSC基因signature评分（图2e）。另外，作者还发现高LS组的肿瘤有更高的M2巨噬细胞和肥大细胞分数以及更低的M1巨噬细胞和淋巴细胞分数（图2f）。
图2c.抑制性MDSC基因的富集情况；图2d.LS分数与MDSC signature的关系；图2e.高低LS组的MDSC基因signature评分；图2f.高低LS组的各类免疫细胞分数对比
3.LS与细胞因子
因为趋化因子在募集免疫细胞过程中的重要作用，作者接下来将目光放到了对它的相关研究上。对42种趋化因子的无监督分层聚类结果显示与CXCR2这个受体相关的趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5和CXCL8在CESC中存在相似的表达模式（图3a），而这些趋化因子在高LS组中相对于低LS组显著高表达（图3b）。除趋化因子以外，作者还研究了中性粒细胞与单核细胞的集落刺激因子CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)和CSF3(G-CSF)，发现高LS组肿瘤的CSF2和CSF3相对于低LS组显著高表达（图3c）从以上结果我们可以得出结论——高LS组肿瘤展现了对中性粒细胞与MDSC的趋化潜能，以及相对于低LS组出现某些细胞集落刺激因子的高表达。
图3a.基于高低LS组与趋化因子的层次聚类；图3b.高低LS组与趋化因子的关系；图3c.高低LS组与集落刺激因子的关系
4.TRL/LS与免疫治疗
考虑到MDSC对免疫检查点阻滞疗法的负面影响，作者接下来研究了TRL/LS分组肿瘤对于抗PD-1疗法的响应情况。作为多种肿瘤抗PD-1疗法响应情况的指标，T细胞炎症signature在TRL阴性组肿瘤中显著富集（图4a），低LS组肿瘤的T细胞炎症signature评分也有比高LS组更高的趋势，但P=0.0581，处于显著性阈值边界（图4b）。但作为另一个抗PD-1疗法响应情况指标的肿瘤新生抗原，在高低LS组肿瘤未表现出显著的差异性（图4c）。最后，对TCR和BCR多样性的研究中发现二者多样性在高LS组肿瘤中显著较低（图4d）。以上结果提示TRL阳性以及LS评分较高可能对应着更差的免疫治疗疗效。
图4a.T细胞炎症signature的富集情况；图4b.高低LS组与T细胞炎症signature评分的关系；图4c.高低LS组与肿瘤新生抗原的关系；图4d.高低LS组与TCR、BCR多样性的关系
5.LS与泛癌分析
为了拓展在TCGA CESC中研究的结果，作者在TCGA的泛癌队列中研究了9984个病人的32种实体肿瘤。进行生存分析后作者发现，高LS组的病人预后显著差于低LS组（图5a）。此外，高LS组肿瘤相对于低LS组的MDSC signature评分显著更高（图5b）。与在TCGA CESC队列中观察到的一致，高LS肿瘤展现出更高的损伤修复signature评分，更低的 IFN-γ response，TGF-β response，单核/巨噬细胞活化以及淋巴细胞炎症signature评分（图5c）。对趋化因子表达情况的分析也发现，高LS组肿瘤趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5和CXCL8的表达显著高于低LS组，集落刺激因子CSF2和CSF3也显著更高。
图5a.泛癌队列中高低LS组与预后；图5b.泛癌队列中高低LS组与MDSC signature；图5c.泛癌队列中高低LS组与免疫相关过程
对泛癌队列的生存分析提示在肾上腺皮质癌，膀胱尿路上皮癌，头颈鳞状细胞癌，肾嫌色细胞癌，肾透明细胞癌，肾乳头状细胞癌，肝细胞癌，肺腺癌，间皮瘤，肉瘤，黑色素瘤，子宫内膜癌，葡萄膜黑色素瘤中高LS组相对于低LS组预后更差（图5d），值得注意的是，脑低级别胶质瘤（LGG）表现出了低LS对应预后更差的情况，这样的结果表明使用LS作为预后指标背后的具体机制需要进一步的深入研究。
图5d.泛癌队列的生存分析结果
我们可以简要梳理一下作者的研究思路：先从文献中获知TRL阳性可能对应更差的预后，为验证这一点，作者先找了4名TRL阳性和4名TRL阴性CESC患者进行RNA测序并收集基线和随访资料，发现患者在基因表达以及预后方面都存在差异。为了验证这种差异，作者又从TCGA数据库中获取了更多CESC患者的相关资料，并使用LS评分代替白细胞计数，观测到了高低LS组的基因表达、免疫微环境、免疫及损伤修复相关通路、细胞因子、免疫治疗疗效、预后等方面都存在差异。最后，作者将研究延拓到TCGA的泛癌数据，发现高低LS组的预后和相关通路的signature评分与TCGA CESC数据中有类似的趋势，并在某些癌症中观测到了类似的因LS高低而存在差异的预后。
小结
作者从一个在某些肿瘤患者中观测到的异常指标——肿瘤相关白细胞入手，并通过将LS分数作为无白细胞计数患者的替代指标而使研究可以从8名患者的数据延拓到TCGA CESC数据集以至于TCGA的泛癌数据。文章中的“替代”和“由点及面”的思想值得我们学习。但是文章也存在一些不足之处，例如文章中的免疫治疗疗效相关研究部分，同时存在“显著”，“临界”（P=0.0581）以及“不显著”的结果，提示这部分的研究尚有继续深入的空间。