无菌动物模型名词解释、技术特点及应用

一、无菌动物介绍

无菌动物系一种理想的动物模型。无菌动物饲育研究始于19世纪末，本世纪40年代证明无菌生命可以存活，由于无菌隔离器和无菌动物饲育方法的改进，国外已育成无菌大鼠、小鼠、羊、猫、狗、猪、小牛、马驹、猴、鸡等。无菌动物具有很多特征;生命比普通个体长;消化系统盲肠肥大、肠管肌层薄、小肠绒毛细、肝重量减轻;血液总量少，白细胞少，红细胞增多;脾脏缩小，网状内皮细胞功能下降;肾脏小，皮质功能低;不能合成维生素D、K，肠壁物质交换慢;淋巴系统不发达，淋巴结小，免疫球蛋白与自然抗体水平低，胸腺功能低，吞噬细胞功能低下，成年个体骨髓移植可成功等。无菌动物在科学研究中具有重要意义，如用于微生物学研究、免疫学研究、老年学研究、致癌与防癌研究、放射病研究、营养学研究、病理与药理学研究、生态治疗与生态预防及在宇航中生理学的研究以及对多种疾病的研究等。

无菌动物的“菌”主要是指细菌，而严格来说，还包括真菌、立克次体、支原体和病毒等微生物及各种寄生虫。而所谓“无”不是绝对的，不过是根据现有的科学知识和检查方法在一定时期内不能检出已知的微生物和寄生虫而已。随着科学技术的发展，现在认为是无菌的动物或许将来可以检出微生物和寄生虫而不是无菌动物，因此这个“无”是相对而言的。

用大量抗生素也可以使普通动物暂时无菌，但是这种动物不是无菌动物。因为这种无菌状态往往是一过性的，某些残存的细菌在适当的条件下又会在体内增殖；即使能把体内细菌全部杀死，它们给动物造成的影响却是无法消除的，如特异性抗体的存在、网状内皮系统的活化、某些组织或器官的病理变化等。因此，无菌动物必须是生来就无菌的动物。

二、无菌动物的发展

无菌动物的研究起源于19世纪后期，1885年确立了动物在体内没有微生物的情况下也能生存的概念。对无菌动物的研究最初只是为了探讨高等动物与体内微生物之间的关系。随着生物学的进步和技术的发展，试行了各种动物的无菌化，而无菌动物因为具有独特的优越性使其成为一种新型的实验动物。现在无菌动物的品种已经很多，不仅小鼠、大鼠、豚鼠和家兔等小动物已有无菌动物，而且狗、猫、猴、猪、山羊、绵羊和牛等大动物以及鸡、火鸡、鹌鹑、青蛙、蛇，甚至蚕、苍蝇、白蚁等也都有了无菌动(生)物。这些都是为了适应科学发展的需要而培育的，其中的小鼠、大鼠、豚鼠等在国外一些发达国家已能大量生产，并比较方便地应用于日常研究中了。已育成的无菌动物见表2-2。

表2-2  已育成的无菌动物

三、无菌动物技术

无菌动物在自然界并不存在，必须用人为的方法养育而成。无菌动物的理论基础和实践依据在于胎盘屏障和屏障观念。在无菌条件下取仔，一切操作在无菌隔离器内进行。一般将临产前的健康动物用麻醉药物或拉断颈椎处死后，立即浸泡在37℃灭菌液中，送进无菌室(或无菌隔离器)，按无菌手术进行剖腹，切除带胎子宫(子宫内首先应无菌)，将其浸入消毒液里并立即输送到另一只隔离器中，切开子宫取胎，经用灭菌纱布揩拭仔体并断脐(电刀切断)后，放入隔离器内人工喂乳或用其他品系的无菌雌鼠做保姆代养。

四、无菌动物的特征

无菌动物发育正常，外观和普通动物相同。但是由于其特殊的培育方法，其功能、结构和普通动物有很大的不同。无菌动物的特征主要反映在以下2个方面。

1．形态学改变

(1)消化系统：肠道肌层薄、盲肠肥大、肠黏膜绒毛增多、肝重量下降。

(2)循环系统：心脏相对缩小。

(3)血液系统：白细胞增加，普通动物白细胞总数波动范围大，无菌动物白细胞数值恒定。

(4)单核-吞噬细胞系统：脾缩小，无三级滤泡，单核-吞噬细胞功能降低。

2．生理学改变

(1)免疫功能：由于单核-吞噬细胞系统、淋巴组织发育不良，淋巴小结内缺乏生发中心，产生丙种球蛋白的能力很弱(在检查无菌动物的无菌性时，血清丙种球蛋白阴性可以作为无菌的1个辅助证据)。体内无微生物和寄生虫，血中无抗体，血清杀菌力低，吞噬细胞噬菌力也低，因此对微生物感染异常敏感。

(2)生长率：无菌条件下对不同种属影响不同。无菌鸟类生长率高于同种的普通鸟类；无菌大、小鼠与普通鼠差别不大；无菌豚鼠和无菌兔生长率比普通者慢。

(3)生殖：无菌条件对动物的生殖影响不大。大鼠和小鼠因出生无感染身体较好；无菌豚鼠及兔比普通者繁殖力低，可能因大盲肠之故。

(4)代谢：血中含氮量少，肠道对水的吸收率低，代谢周期比普通动物长。

(5)营养：无菌动物肠道上皮细胞更新率比一般动物低，肠壁的物质交换也较慢。无菌条件下的各种动物通过胆汁排泄代谢产物的速率均减慢。

(6)寿命：无菌大鼠和小鼠比普通者长寿。

五、无菌动物的饲料和饲育装置

1．无菌动物的饲料  无菌动物的饲料必须符合下列要求。

(1)没有活的微生物和寄生虫或虫卵。

(2)必须补充因高压灭菌而破坏的营养成分。

(3)无菌动物没有肠道正常菌丛，饲料中还须补充这些细菌合成的营养成分。

(4)饲料的组成、形态和气味等应尽可能适合动物的习性和嗜好。

2．无菌动物的饲育装置  无菌动物必须在与自然界微生物完全隔绝的无菌隔离器内饲育。旧式的无菌隔离器是用不锈钢等金属材料制成的，内部用高压蒸汽消毒，由于成本高、操作不方便，现在已被塑料无菌隔离器所取代。塑料隔离器是用硬透明塑料制成的，内部用过氧乙酸等消毒液喷雾消毒，由于成本低、便于观察、操作方便，目前已被广泛采用。我国生产的塑料隔离器最近在中国医学科学院实验动物中心已通过鉴定，并已成批生产。

无菌隔离器必须具备下面5个条件。

(1)必须是1个对微生物密闭的容器，其内部空间和内容物能接受高压蒸汽或化学药品灭菌处理。

(2)隔离器的空间以及内容可随时被观察。

(3)隔离器内部应随时在视野下从外部进行工作，但不破坏内部的无菌环境。

(4)必须装置1个有内、外门的无菌通道，动物或食物以及其他物品可以从外部无菌地输送到隔离器内部去，而不破坏内部的无菌环境，送出时亦然。

(5)必须装置1个无菌进行出气系统，内部保持适度的高气压。

六、无菌动物的检查

为了确认无菌动物的无菌状态，及时发现污染，必须定期对其进行检查。检查材料以粪便为主，也可检查饲料、饮水和铺垫物等，或用消毒棉花擦拭隔离器内面或对动物饮食器皿表面进行培养。培养基可用牛肉浸液、硫乙醇酸盐培养基、血液琼脂、马铃薯琼脂或沙保弱琼脂等，分别在20℃、37℃、55℃做好气和厌气性培养。同时还要进行呼吸道支原体的检查和各种寄生虫检查，对于病毒，不可能一一进行分离培养，一般是通过临床观察、细胞培养或病理组织学检查作判定。

七、无菌动物在生物医学研究中的应用

无菌动物并不等于普通实验动物除去了微生物。人工培育的无菌动物适应了无菌生活，所以在形态、生理、代谢及机体防御等方面都具有一定的特点。由于在这种动物的机体中排除了各种微生物的干扰，就可以对其他科研问题的实验，得出较明确的结果。另外，如将单一已知微生物接种到无菌动物体内，就可以研究机体和单一纯微生物的相互关系。

无菌动物在生物医学研究中因具有独特作用，因此多年来在医学科学研究的很多方面已被广泛应用。在医学科学研究的各专门领域里，应用无菌动物进行实验研究的项目主要有以下几方面。

1．在微生物学研究中的应用

(1)研究某些疾病的病原：无菌动物可提供组织培养的无菌组织；可提供具有某一种菌的已知菌动物；也可研究病原体的致病作用与机体本身在内的关系，如猫瘟病毒，正常猫易感染，无菌则不易受感，说明感染受肠道微生物的影响。

(2)研究微生物间的拮抗作用：菌群之间的拮抗作用是生物屏障的一种。生物屏障可能比物理屏障更有效。生物屏障原理为生物间的拮抗作用。如利用无菌动物来研究哪种菌可拮抗假单胞菌，对放射研究甚为重要，因照射后常出现此菌。又如在把无菌动物放入SPF环境前，先分别给无菌动物喂以大肠埃希菌、乳酸杆菌、链球菌、白色葡萄球菌、梭状芽胞杆菌等5种菌群，再观察这些菌群间的拮抗作用。

(3)研究病毒疾病：无菌动物是研究病毒疾病、病毒性质、纯病毒、安全疫苗和单一特异性抗血清的有用工具。

(4)研究细菌学：尤其是肠道正常菌丛细胞间的相互拮抗性及细胞和宿主间的关系的研究。

2．在免疫学研究中的应用  无菌动物血中无特异性抗体，很适合免疫学的研究。

(1)研究免疫系统功能和机体受感染后感受性改变的关系：由于在无菌动物机体内除去了生活的微生物，使无菌动物大大增强了对感染的感受性。如将无菌豚鼠从无菌系统中移到普通动物饲养区，常在几天内死亡，病因经常是梭状芽胞杆菌的感染。

(2)研究细胞介导免疫及其在癌瘤预防上作用：当研究细胞介导免疫及其在癌瘤预防上的作用时，就更需要测定微生物菌群在刺激体液和细胞介导免疫反应中的作用及对自身免疫反应中的可能作用。

(3)研究丙种球蛋白和特异性抗体：无菌动物血清中γ-球蛋白含量下降。球蛋白来源于消化道中死菌的刺激。用无抗原性饲料喂无菌动物(如无菌小白鼠喂以水溶性低分子化学饲料时)，小白鼠血清中就可以完全缺乏丙种球蛋白。在无菌小猪中用无抗原性或有限抗原性的饲料时，血清里就可完全没有丙种球蛋白和特异性抗体存在。

3．在放射医学研究中的应用  用无菌动物研究放射的生物学效应，就可以将由放射所引起的症状和因感染而发生的症状分别开来。无菌动物能耐受较大剂量的X线照射。在用致死剂量照射后动物的存活时间也要长些。因放射而引起的黏膜损伤，无菌动物比普通对照动物要轻。

4．在营养、代谢研究中的应用

(1)营养学研究：很多营养成分是靠细菌降解的。正常动物的肠道可合成维生素B和维生素K。应用无菌动物可研究哪些菌可合成维生素B或维生素K。

(2)代谢研究：如胆固醇代谢和微生物关系的研究。用已知菌动物研究指出，肠道微生物能使胆汁酸起化学变化，从而减少其再吸收，而增加其排泄。有些特殊的微生物种类与这种胆汁酸的代谢有关，这就为控制血清胆固醇含量和心血管疾病的研究，提出了新的课题。

5．在老年病学研究中的应用  无菌小白鼠的自然死亡期比普通小白鼠为长，而且雄性无菌小白鼠的寿命与雌性相似或更长些。对2～3年龄无菌大白鼠的检查结果表明，在肾、心脏和肺里实际上没有和年龄相关的病变，这些研究说明，微生物因素和机体的老化有关，而以前一般都认为起源于内因或完全与饮食有关，通过用已知菌动物对这些变化的直接原因进行研究，会对合理地控制衰老有一定裨益。

6．在毒理学研究中的应用  药物或其他物质的毒理作用常常与肠道细菌代谢产物有关。如正常豚鼠对青霉素敏感，而无菌动物则无此反应。因此，青霉素过敏是因肠道细菌代谢过程中引起的过敏。用大豆喂养动物，发现有中毒现象，但用同样食物喂无菌动物则无影响。用大豆喂无菌鸡也无影响。有些用鹌鹑进行研究，将其感染大肠埃希菌后再喂豆类可引起中毒。

7．在肿瘤研究中的应用  无菌动物适用于微生物及其代谢产物与肿瘤关系的研究。另外，抗肿瘤药物如免疫抑制药物的研究要用无菌动物进行实验，因普通动物应用免疫抑制药可降低其抵抗力，致其继发感染而死亡。

8．在寄生虫学研究中的应用  长膜壳绦虫为大鼠的寄生虫，给无菌大鼠人工感染这种寄生虫时则不能寄生，这可能与缺乏维生素有关。溶组织性阿米巴对无菌豚鼠不引起肠道黏膜的损伤；而普通豚鼠则出现肠黏膜病变。无菌大白鼠不发生龋齿。从普通大白鼠的肠道里曾分离出一种链球菌，证明其有致龋齿作用。众所周知，无菌鼠饲养繁育体系要求极其严苛，一点点的失误便会造成整个无菌体系全军覆没。赛业生物严格执行Taconic系统规范的无菌鼠饲养繁育体系，并通过Taconic公司技术体系的审核与认证。自引进以来，三年未发生一次污染，创造了国内无菌鼠饲养繁育体系的新记录。

来源：《眼科实验动物学》 作者：魏世辉、王志军 主编