特别关注｜GITR/GITRL在肝脏疾病中的作用
糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR/TNFRSF18)属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族, 由Nocentini等[1]于1997年从地塞米松处理的T淋巴细胞杂交瘤中发现, 随后于1999年和2003年分别从人脐带内皮细胞[2]和小鼠脾细胞[3]中克隆出了能与GITR特异性结合的GITR配体(GITRL/TNFSF18)。作为重要的T淋巴细胞协同刺激分子, GITRL/GITR主要通过活化效应T淋巴细胞与调控调节性T淋巴细胞(Treg)参与炎症介导的疾病发生与进展过程, 干预GITRL/GITR通路具有清除病毒与寄生虫感染、增强抗肿瘤治疗效果的作用, 因而成为了备受关注的免疫分子。本文将对GITRL/GITR的生物学特性与其在肝病研究中的进展进行综述。
1GITRL/GITR的分子结构与表达特点
人GITRL基因位于染色体1q25.1, 编码由177个氨基酸组成、分子量为20 kD的跨膜蛋白, 包含胞内段(28个氨基酸)、跨膜结构域(21个氨基酸)、胞外段(128个氨基酸)三部分[2]。GITRL主要表达于抗原递呈细胞, 包括内皮细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞等[4-5]。
人GITR基因位于染色体1p36.33, 编码由228氨基酸组成、分子量为26 kD的跨膜蛋白, 包含胞内段(58个氨基酸)、跨膜段(21个氨基酸)和胞外段(137个氨基酸)三部分[2]。其胞内段与其他TNF家族成员一样均可募集TNF受体相关因子(TRAF)传递下游信号, 但不具有其他TNF家族成员共有的凋亡结构域。GITR主要表达于胸腺、脾和淋巴结中的T淋巴细胞[1], 在小鼠中GITR持续高表达于Treg, 尽管静息状态的自然杀伤细胞(NK细胞)、效应T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞中GITR表达水平很低, 但这些细胞活化后GITR表达显著增加[6]。
2GITRL作为协同刺激信号通过GITR影响免疫细胞的功能
GITRL可以直接与GITR特异性结合, 也可以被酶切后形成可溶性胞外段与GITR特异性结合。GITRL/GITR作为协同刺激信号主要影响T淋巴细胞, 不仅具有促进效应T淋巴细胞增殖与细胞因子分泌的作用, 同时还具有调控Treg增殖和抑制效应T淋巴细胞功能的作用, 从而发挥调控效应T淋巴细胞功能的作用。GITRL/GITR配体-受体信号影响免疫细胞的作用与功能见表 1, 本文将对其作用于T淋巴细胞, 主要是效应T淋巴细胞、Treg和辅助性T淋巴细胞(Th), 进行重点讨论。
2.1 GITRL/GITR作为协同刺激分子活化效应T淋巴细胞发挥促炎作用
效应T淋巴细胞静息状态GITR表达水平很低, 经T淋巴细胞受体(T-cell receptor, TCR)活化后或CD28刺激后GITR表达显著增加[6-7]。GITR不仅可以被表达于抗原递呈细胞表面的GITRL所激活, 还可以被GITR抗体、可溶性GITRL或通过转染GITRL过表达质粒等方式所活化。对于经典的效应T淋巴细胞, 活化GITR发挥共刺激作用促进效应T淋巴细胞的存活、活化与增殖[8]。如果单独应用GITR抗体激活GITR并不能促进CD4+CD25-效应T淋巴细胞的增殖, 但如果联合应用CD3抗体和GITR抗体进行刺激, 较单独应用CD3抗体时, CD4+CD25-效应T淋巴细胞ERK磷酸化水平进一步升高, 细胞增殖能力进一步增加, 炎症因子IL-2与IFNγ表达进一步增多, 并且抑制CD3抗体诱导的细胞凋亡[8-9]。应用人CD19启动子驱动B淋巴细胞过表达GITRL的转基因小鼠进行研究[10]发现, 过表达的GITRL具有活化GITR并刺激CD4+ T淋巴细胞增殖的作用。应用GITR-/-CD8+ T淋巴细胞的研究[11-12]也发现, GITR作为协同刺激分子通过TRAF2和TRAF5调控NF-κB/BCL-XL通路参与CD8+ T淋巴细胞的活化与增殖过程。但对于CD28共刺激分子的应答过程, GITR在CD4+ T淋巴细胞和CD8+ T淋巴细胞的作用却明显不同：GITR直接参与了CD8+ T淋巴细胞对CD28刺激的应答, 并降低CD8+ T淋巴细胞活化的阈值, 而GITR不影响CD4+ T淋巴细胞对CD28的应答过程[11]。
2.2 GITRL/GITR影响Treg细胞的增殖与功能调控过程
与效应T淋巴细胞静息状态低表达GITR, 而活化后高表达GITR不同, Treg特征性高表达GITR[4-5], Treg活化后、抑制抗原受体信号基因Ptpn22表达后或在肿瘤微环境中GITR表达进一步升高[13-15]。作为共刺激信号, GITRL/GITR参与了Treg前体细胞在胸腺中的成熟分化过程和Treg的增殖与功能调控过程。
在胸腺中, Treg前体细胞高表达GITR和OX40, 而胸腺抗原递呈细胞(如DC)表达GITRL和OX40L, GITRL/GITR与OX40L/OX40的共刺激作用增加Treg前体细胞对IL-2R的敏感性和转录因子STAT5活化, 促进FoxP3表达与Treg前体细胞成熟分化为Treg, 敲除GITR后能够阻断Treg在胸腺中的发育过程[16]。
在Treg功能调控方面, GITRL/GITR信号的功能仍未达成共识[17]。研究[10]发现, GITRL通过直接刺激CD4+FoxP3+ Treg增殖而使其数量显著增多, 且这些细胞处于表型活化状态并具有抑制效应T淋巴细胞的功能。应用MHC-Ⅱ+启动子驱动抗原递呈细胞表达GITRL的转基因小鼠研究[18]发现, Treg数量增加了5倍, 而且具有抑制原始T淋巴细胞增殖作用的FoxP-IL-10+的Ⅰ型调节性T淋巴细胞数量显著增加。上述结果提示, GITRL/GITR信号作用于Treg可促进其增殖, 增强其免疫抑制功能。
然而, 应用GITR特异性激活抗体DTA-1处理BALB/c小鼠3周后(每周1次), 尽管效应T淋巴细胞和Treg数量没有明显变化, 但可抑制Treg的免疫抑制功能, 诱发自身免疫性疾病[6, 19]。GITR特异性激活抗体DTA-1也可以降低肿瘤浸润Treg的数量及其抑制功能, 增强肿瘤杀伤性CD4+与CD8+ T淋巴细胞的作用, 进而打破肿瘤中Treg形成的免疫抑制性微环境, 发挥抑制肿瘤生长的抗肿瘤作用[20-21]。
2.3 GITRL/GITR信号对Th的调控作用
近年发现GITRL/GITR信号亦参与了Th(包括Th17、Tfh和Th9)的形成、增殖与功能调控过程。GITRL可诱导原始CD4+ T淋巴细胞表达RORγt, 并促进Th17的增殖, 应用GITRL处理正常小鼠也可引起脾内Th17的扩增[19]。
在胶原诱导的自身免疫性关节炎小鼠模型中和关节炎患者中, 血清GITRL水平显著增加, 且与疾病严重程度和Th17数量呈正相关, 应用GITRL处理后能够促进Th17扩增, 进一步加重疾病的严重程度[19]。在胶原诱导的小鼠关节炎模型中, CD4+Tfh较非Tfh的GITR表达水平显著升高[22]。活化GITR信号可增加Tfh的比例和数量[22], 调控Tfh分化(即增加效应Tfh与调节性Tfh比例)[23]和促进T淋巴细胞依赖性的抗体应答过程[24]。缺乏GITR信号或应用GITRL/GITR相互作用的竞争性抑制剂GITR-Fc可降低Tfh辅助自身抗体合成功能, 降低Tfh应答反应, 减轻自身免疫性疾病的严重程度[22, 25]。而GITR激活性抗体DTA-1通过抗原特异性模式经IL-4/c-Maf通路增加表达IL-21的Tfh数量, 增强肿瘤特异性细胞毒性CD8+ T淋巴细胞的杀伤肿瘤细胞的功能[26]。
GITR激活性抗体DTA-1可以与IL-4协同, 通过TRAF6/NF-κB途径诱导CD4+ T淋巴细胞分化为Th9的作用, 进而增强肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的应答反应[27]。
GITR 对效应T淋巴细胞和 Treg 调节和增殖的影响
doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01753.x.
3GITR/GITRL逆向信号调控抗原递呈细胞功能
表达于抗原递呈细胞(如内皮细胞、DC、巨噬细胞等)的GITRL可以被GITR-Fc、可溶性GITR或抗GITRL抗体所活化, 由于GITRL具有胞内结构域, 在与GITR结合后该结构域能够传递逆向信号影响表达GITRL细胞的功能[28](表 2)。
3.1 GITR/GITRL逆向信号增加内皮细胞黏附分子表达、促进炎症细胞黏附迁移的作用
GITRL高表达于人血管内皮细胞, 在炎症情况下IFNα与IFNβ具有进一步促进其表达的作用[29]。GITR-Fc活化GITRL可以促进内皮细胞STAT1a与STAT1b的磷酸化、增加ICAM-1和VCAM-1的表达、促进炎症细胞的黏附和迁移[30]。
3.2 GITR/GITRL逆向信号抑制DC的功能
DC既表达GITR也表达GITRL, 尤其当DC处于活化状态时, GITRL表达进一步增加[5]。GITR活化DC的GITRL后可激活NF-κB信号, 抑制具有促炎作用的IL-12的表达[31], 促进具有抑炎作用的吲哚胺2, 3-二氧化酶表达[32], 进而发挥免疫抑制作用, 平衡GITR活化T淋巴细胞的促炎作用。
3.3 GITR/GITRL逆向信号刺激巨噬细胞聚集和与细胞外基质黏附的作用
与DC类似, 巨噬细胞既表达GITR, 也表达GITRL。GITRL抗体或GITR-Fc重组蛋白处理原代培养的巨噬细胞或巨噬细胞系THP-1, 活化GITRL通过ERK/NF-κB途径诱导巨噬细胞表达促进炎症反应的细胞因子、基质金属蛋白酶并上调ICAM-1的表达, 可以促进巨噬细胞的聚集和与细胞外基质的黏附[33-35]。
GITRL 在巨噬细胞 (A)、DC (B) 和肿瘤细胞 (C) 中触发或抑制的作用
doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01753.x.
4GITRL/GITR协同刺激信号在肝脏疾病中的研究进展
相对于其他器官、系统的炎症性疾病, GITRL/GITR在肝脏疾病中的研究还相对较少, 目前的研究主要集中于GITRL/GITR调控效应T淋巴细胞与Treg功能, 进而影响肝移植术后、基因治疗后的免疫耐受与肝肿瘤细胞的免疫逃逸方面。
4.1 GITRL/GITR参与了Kupffer细胞调控的肝脏炎症损伤过程
小鼠腹腔注射脂多糖24 h后, 肝脏非实质细胞中, 尤其是Kupffer细胞中, GITRL表达显著增加, 应用GITRL siRNA抑制Kupffer细胞中GITRL表达后, 促炎细胞因子TNFα和IL-6分泌显著降低, 表明GITRL具有促进促炎细胞因子TNFα和IL-6分泌的作用[36]。地塞米松可通过降低Kupffer细胞中GITRL表达、减少TNFα和IL-6分泌, 进而减轻脂多糖诱导的肝损伤[36]。
4.2 GITRL/GITR参与肝移植术后的免疫排异过程
异种异体肝移植大鼠研究[37]显示, Kupffer细胞GITRL表达显著增加, 并调控了肝移植术后免疫排异反应。应用肝移植患者术后血液DNA样本, 经焦磷酸测序分析显示, 无慢性免疫排斥反应的患者GITRL的甲基化水平显著低于有免疫排斥反应的患者, 而GITR基因的甲基化水平无明显变化[38]。由于GITRL甲基化水平降低对应GITRL转录、表达增加, 提示外周血GITRL表达增加与肝移植患者术后免疫排异反应密切相关。目前尚缺乏表达增加的GITRL如何通过GITR信号调控Treg与效应T淋巴细胞影响肝移植术后免疫排斥反应的研究。
4.3 GITRL/GITR参与Treg调控的基因治疗的免疫耐受过程
在基因治疗过程中, 转基因产物存在被免疫系统识别并清除的风险。在靶向肝脏的基因治疗中, 肝脏需要产生针对特异外源蛋白的免疫耐受, 只有在肝脏微环境中诱导抗原特异性Treg, 并刺激其大量增殖, 才能避免外源基因产物被清除, 达到基因治疗的目的。AAV8-OVA基因注射后, GITRL-/-小鼠中抗原特异性Treg数量下降, 而抗原特异性CD8+ T淋巴细胞显著增加, 表明GITRL是Treg调节机体对外源基因形成免疫耐受所必须的共刺激信号[39]。应用人凝血因子Ⅸ基因治疗失败的C3H/HeJ遗传性出血性疾病小鼠模型, 注射GITRL-Fc后, 由于GITRL-Fc对Treg的增殖促进作用(11倍)显著高于对效应T淋巴细胞的增殖促进作用(1.5倍), 进而诱导免疫耐受, 使得靶向肝脏的人凝血因子Ⅸ基因表达增加, 表明Treg在抑制效应T淋巴细胞清除外源基因方面发挥了关键性的作用[40-41]。因而, 可利用GITRL-Fc参与诱导外源基因特异性Treg, 避免外源转基因产物被免疫细胞清除, 进而提高基因治疗的效果。
4.4 高表达GITR的Treg参与了肝肿瘤的免疫逃逸过程
作为效应T淋巴细胞的协同刺激分子, 在肿瘤治疗中通过活化GITRL/GITR信号增强效应T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的功能, 降低Treg的免疫抑制功能[20], 以达到治疗肿瘤目的, 已经成为了新的肿瘤免疫治疗策略, 受到越来越多的研究者关注。
在慢性乙型肝炎患者(15例)和肝细胞癌患者(49例)中, 外周血Treg和肝脏浸润Treg数量显著增加, 且慢性乙型肝炎患者Treg不仅能够抑制HBV抗原诱导的免疫反应, 也能够抑制肝细胞癌肿瘤抗原诱导的免疫反应。与和HepG2细胞共培养的外周血单个核细胞相比, 转染HBV基因的HepG2.2.15细胞共培养的外周血单个核细胞中CD4+CD25+Treg数量更多, 叉头状转录因子3、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4、GITR表达水平更高, 对肿瘤抗原NY-ESO-1或MAGE-A3诱导的特异性免疫反应有更强的抑制作用[41], 提示GITR可能参与了HBV感染导致的机体免疫抑制功能增加、抗肿瘤免疫反应下降, 参与了慢性乙型肝炎到肝细胞癌的病理发生过程。
与非肿瘤肝组织相比, 肝细胞癌、胆管癌和结肠癌肝转移患者的肿瘤组织中, 表达GITR的Treg数量显著增加, 且这些细胞抑制效应T淋巴细胞增殖的功能也显著增强[13, 42-44]; 而效应T淋巴细胞在肿瘤内部数量较少, 多位于肿瘤边缘[44], 且肿瘤特异性增殖能力与发挥裂解肿瘤细胞功能的分子表达均显著下降, 表明免疫抑制微环境在肝肿瘤形成过程中发挥了重要的作用[38, 40]。体外应用重组GITRL或人源GITR活化抗体, 可以刺激从患者肿瘤组织中分离的肿瘤抗原特异性CD4+和CD8+T淋巴细胞的增殖, 并促进IFNγ和颗粒酶B的分泌, 提示GITRL可以提高效应T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的功能[43-44]。当从患者外周血和肿瘤组织中分离的Treg与效应T淋巴细胞共培养时, GITRL能够降低Treg对效应T淋巴细胞的抑制作用[37, 39], 提示靶向GITR可以作为一种新的肝细胞癌免疫治疗策略。在Clinical Trial上注册的4项单独应用GITR活化抗体治疗黑色素瘤、肺癌、肾癌等恶性肿瘤的项目处于Ⅰ期或Ⅱ/Ⅱ期[45], 用于治疗肝肿瘤的研究尚未见到相关的注册研究项目。
5总结与展望
综上所述, GITRL/GITR协同刺激信号在肝移植术后、基因治疗后免疫排异与肝肿瘤的免疫逃逸过程中发挥了重要的作用, 通过干预GITRL/GITR协同刺激信号调控Treg与效应T淋巴细胞的功能, 对于改善肝移植术后、基因治疗后免疫排斥问题和有效杀伤肿瘤细胞方面都有很好的应用前景。但是, 目前基于GITRL/GITR协同刺激信号在其他肝脏疾病发生和进展中作用的研究尚比较少, 尤其是在抗感染与改善自身免疫性肝病方面, GITRL/GITR协同刺激信号是否参与其中、作用机制怎样, 仍是值得深入研究的问题。
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http://www.lcgdbzz.org//cn/article/doi/10.3969/j.issn.1001-5256.2021.07.051
何宇, 贾继东, 王萍. 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白及其配体在肝脏疾病中的作用[J]. 临床肝胆病杂志, 2021, 37(7): 1718-1723.
本文编辑：刘晓红
公众号编辑：邢翔宇
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