【生化】Chem. Sci.：一种用于泛酰巯基乙胺酶检测的近红外荧光探针
泛酰巯基乙胺酶是一种酰胺水解酶，常被称为血管非炎性分子vanin-1，可将泛酰巯基乙胺分解为泛酸和半胱胺，在肝、肠、肾和肺等多种器官都有着高表达。近年来，许多研究表明泛酰巯基乙胺酶在炎症以及其他疾病方面有着潜在的作用。例如，vanin-1基因敲除小鼠对药物引起的肝损伤表现出更高的敏感性，表明泛酰巯基乙胺酶具有一定的酶促保护作用。此外，泛酰巯基乙胺酶在肾脏损伤和炎症性肠病早期均表达上调，且其抑制剂可以减轻急性和慢性肠道疾病中的氧化应激和炎症，这表明泛酰巯基乙胺酶是促炎因子。因此，寻求一种合适的方式用于泛酰巯基乙胺酶的检测显得尤为重要。
基于此，北京中国科学院化学研究所的史文副研究员和马会民研究员设计合成了一种新型近红外荧光探针CYLP，以自分解的长链作为linker将荧光团和识别基团泛酸相连接，用于泛酰巯基乙胺酶的生物成像。相关成果以“A near-infrared fluorescence probe for imaging of pantetheinase incells and mice in vivo”为题发表在Chemical Science上（DOI: 10.1039/d0sc04537c）。
首先，作者将泛酸直接偶联至氨基半菁荧光团上构建了一个荧光探针（control，Scheme 1）,期望在泛酰巯基乙胺酶的作用下释放NIR荧光，但结果并不理想，这可能是因为荧光团和催化位点的空间位阻影响了底物进入活性中心。为了解决这一难题，作者将自分解的长链作为linker连接大分子荧光团和泛酸，得到探针CYLP（Scheme 1），其在近红外波段（＞700 nm）下对泛酰巯基乙胺酶表现出优异的选择性和灵敏性。
（来源：Chemical Science）
随后，作者探究了CYLP对泛酰巯基乙胺酶的响应性。CYLP（10 mM）在NIR区域几乎不显示荧光（量子产率＜0.1%）；而在泛酰巯基乙胺酶（50 ng/ml）的作用下，其在710 nm处的荧光增强约40倍（Fig. 1A）。CYLP与不同浓度的泛酰巯基乙胺酶反应的荧光动力学研究结果表明其对泛酰巯基乙胺酶表现出剂量依赖性，且荧光在一小时内达到稳态（Fig. 1B）。除此之外，CYLP的荧光强度与泛酰巯基乙胺酶的浓度（0-50 ng/ml）呈现良好的线性关系（Fig. 1C），且具有特异性（Fig. 1D）。
（来源：Chemical Science）
基于CYLP良好的体外实验结果，作者将其用于活细胞成像中。在四种细胞系（B16、HK2、HepG2和Hela细胞）中，CYLP孵育后的细胞均表现出不同程度的荧光增强（Fig. 2），表明探针可用于细胞内泛酰巯基乙胺酶的成像。而荧光强度的不同可能是不同细胞中泛酰巯基乙胺酶的活性和反应性不一致导致的。
（来源：Chemical Science）
接着，作者将该探针用于泛酰巯基乙胺酶的体内荧光成像。泛酰巯基乙胺酶在体内催化泛酰巯基乙胺水解为泛酸和巯基乙胺，泛酸是辅酶A生物合成的重要组成物质，辅酶A又是参与脂肪酸代谢的重要辅助因子，研究表明泛酰巯基乙胺酶在辅酶A转换率较高的器官（如肝脏和肠道）中具有高表达。因此，作者对此类器官中的泛酰巯基乙胺酶进行活性检测，并以泛酰巯基乙胺酶抑制剂RR6作为阴性对照。在注射CYLP后，实验组的小鼠荧光明显增强，而对照组小鼠的腹部并没有产生荧光（Fig. 3）。这表明CYLP可用于动物体内泛酰巯基乙胺酶活性的荧光成像。
（来源：Chemical Science）
泛酰巯基乙胺酶可以释放半胱胺，从而调节细胞的氧化应激，与许多炎症相关疾病息息相关，因此作者探究了CYLP在小鼠炎症模型中的应用。作者向小鼠的右后腿注射脂多糖溶液诱导炎症，同时向左后腿注射等量的生理盐水作为对照。14小时后，作者将CYLP皮下注射到小鼠双腿中，荧光成像结果表明，小鼠右后腿的荧光强度明显高于左后腿（Fig. 4A）。基于此，作者进一步探究了CYLP在小鼠炎症性肠病（IBD）模型中检测泛酰巯基乙胺酶活性的可行性。与对照小鼠相比，经硫酸葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的IBD小鼠腹部显示出强烈的荧光（Fig. 4C），这表明在该区域泛酰巯基乙胺酶具有高表达。上述实验的成功表明CYLP可以用于动物模型中泛酰巯基乙胺酶的活性检测，直观且方便。
（来源：Chemical Science）
总而言之，作者以自分解的长链作为linker将荧光团和识别基团泛酸相连接，设计并合成了一种新型近红外荧光探针CYLP，用于泛酰巯基乙胺酶的生物成像。该探针显示出高选择性和高灵敏性，并在细胞和小鼠炎症模型中得以应用，为泛酰巯基乙胺酶与相关疾病的生物学研究提供一定的帮助。