【他山之石】美国NIH R01外泌体项目申请指南
2016年5月25日/外泌体资讯网 讯 美国当地时间5月23日，国立卫生研究院（NIH）发布了一份外泌体（exosome）相关的R01项目申请指南。
立项目的（Purpose）
这次的基金机会公告（FOA）的目的是鼓励严谨可重复的外泌体和其他细胞外膜泡的分离及特征分析的创新研究，对其成分进行分析以寻找早期癌症的风险评估、检测、诊断和预后的生物标志物。这份FOA将促进外泌体分离技术的提升，以及在这些膜泡携带货物的计算分析研究。
立项背景（Background）
外泌体的成分可反应癌细胞的状况：跨细胞膜生物成分（如蛋白质、代谢物、核苷酸）的运输是任何正常细胞稳态的一部分。在膜泡运输的机制中，生物成分经由外泌体这种细胞外小膜泡跨细胞膜运输。在病理状态下，如癌症，循环外泌体的成分可反应来源细胞的状态改变（如过高或过低表达的关键蛋白质和microRNAs），因此，具有很高的诊断价值。在过去的十年中，许多研究已经揭示外泌体参与肿瘤相关的通路，如缺氧驱动的上皮至间质转变（EMT）、肿瘤干性、血管生成、恶变形成、转移和耐药，然而，结果多变并不一致。
外泌体和其它细胞外膜泡（EVs）是膜包被的膜泡，可被所有细胞分泌，在血液中循环，且容易在大多体液中获得。这些膜泡的成分包括RNA、DNA、蛋白质，代谢物和脂质，它们可反应其来源细胞的特性，用于开发生物标志物。 EVs被分为外泌体、微泡、凋亡小体和高尔基膜泡。外泌体由多泡小体与细胞质膜融合后释放形成。分泌到细胞外环境的外泌体可作为细胞间信号传导的介质，可以调节基质和内皮组织，并能调节炎症和免疫应答。癌细胞比正常细胞释更多的外泌体，肿瘤细胞分泌的外泌体可促进肿瘤的生长、存活、侵袭和血管新生。分析血液或其它体液中分离的外泌体可丰富对癌细胞生物学的认识，为癌症的早期检测、进展和转移预测提供生物标志物。
外泌体用于癌症检测（Exosomes for Cancer Detection）
外泌体和其他EVs，由于其在生物体液中的稳定性和可能被有效地分离的特性，在针对各类癌症开发非侵入性早期检测标志物方面具有巨大潜力。虽然有几个不同的实验室关注了从正常和肿瘤细胞系中分离外泌体并分析其成分，但并从癌症患者的生物体液分离外泌体的工作仍正在进行中，需要更多的病例对照和前瞻性研究来开发癌症早期发现、诊断和预后的新的生物标志物。此外，外泌体，以及包含在外泌体中的分子，具有潜在与其它分子标记或筛选方式（如，成像）多路复用开发集成基于分子的计算工具用于癌症的早期检测。因此，开发可准确早期发现癌症的基于外泌体生物标志物的检测方法将提高干预策略的有效性。
外泌体包含多种与其来源细胞相关的特异膜表面标志物，它可以用于区分外泌体是有正常细胞分泌还是癌细胞分泌的。外泌体的分离方法有：基于其大小和密度的超速离心、密度梯度离心、差速离心，色谱法，亲和分离，聚合沉淀法和微流体装置分离法。每种方法都有各自的优点和缺点。
癌症特异性外泌体的分离可以提供不含非癌症外泌体和其它循环中污染物的生物标志物。纯化的外泌体含有其来源癌细胞的分子特征，分析这些膜泡的RNA、DNA、蛋白质、代谢物和脂质可增加利用生物标志物用于癌症早期检测、进展和转移的灵敏度。新一代测序分析（NGS）的进步使得我们可在越来越小的体系中分析RNA（microRNA、长链非编码RNA、和mRNA）和DNA（突变和修饰）。外泌体成分的综合分析可用于识别来源的癌细胞及其遗传或表观遗传改变。了解这些信息将有助于癌症的早期检测和癌症分期以及转移的检测，也将有助于癌症进展的监测和治疗干预。
缺乏高效可重复的方法（Lack of Robust and Reproducible Methods）
外泌体用于临床领域的主要挑战之一是缺乏高效可重复分离出纯外泌体的方法。目前缺乏对无类似尺寸微泡/颗粒污染的纯外泌体分离的最佳方法的共识。这是外泌体及其组分应用于临床癌症早期发现和筛查的一个主要障碍。除了外泌体的异质性，许多蛋白质和其它生物分子可以非特异性结合或关联到外泌体表面，从而混淆外泌体组合物的分析。目前用于分离外泌体的方法包括，差速离心和超速离心，过滤，浓缩和磁珠免疫捕获等方法及其它们之间的组合。
用于外泌体来源的分析物的分离、测序文库制备、基因组、蛋白质组和代谢分析的方法是高度多样的。需要经过深思熟虑的实验设备、实验室间的比较和非常详细的实验设计说明，以确保实验结果的可靠可重复。
通过这一举措，NIH期望成功获得基金的申请者将不仅严格评估并改善现有的方法，同时也将分享自己的方法细节以促进外泌体的临床应用。
该项目的特定研究宗旨（Specific Research Objectives）
这一举措旨在支持以下研究（1）开发分离外泌体和其他EVs的有效分离方法，并分析这些膜泡成分；（2）制定评估分离的外泌体和其他EVs成分分析的标准；（3）开发计算工具或新算法将细胞外膜泡成分的数据整合；（4）开发和测试生物标志物和成像方法用于改进癌症的早期检测；（5）预测癌前病变的进展并监测干预措施效果。
用于研究的外泌体的质量对于实验结果的正确性和可重复性是至关重要的。因此，申请人需提出常规鉴定其研究的外泌体的身份和有效性的研究方案。申请者应公开报告其针对鉴定外泌体的方法所做的实验，以保证实验结果的正确性和一致性。建立在这些前提下，NIH鼓励申请者提交规范外泌体分离方法和/或分析其成分用于癌症早期发现的基金申请标书。(exosomemed.com)
研究方向包括但不限于下列选项：
Development of methods for isolation of exosomes and set up standards for internal and external validity.
Development of studies to compare methodologies used for isolation of exosomes.
Discovery and characterization of the cargo including RNA (microRNA, long non-coding RNA, and mRNA), DNA (mutated and modified), protein (post-translationally modified, glycosylated), lipids, and metabolites carried in exosomes.
Development of studies to compare data discovered from characterization of the exosome-derived cargo.
Development of internal standard sets, e.g., standards for microRNA, peptides for MRM, etc. for evaluating cargo as clinical diagnostic markers.
Determination of cancer-specific markers within exosomes.
Determination of the utility of exosomes and their cargo for developing noninvasive assays for early detection.
Development of computational tools or new algorithms to integrate the data on the exosomes cargo to identify novel biomarkers signatures.
Determination of the sensitivity and specificity of biomarkers signatures using cohort or completed trial specimens.
Evaluation of longitudinal screening protocols using cohort specimens.
其他详情请看NIH Grants官网：
http://grants.nih.gov/grants/guide/pa-files/PAR-16-276.html
NIH R01项目简介：
NIH重点资助科学家的个人申请项目，从分子、细胞生物学研究到新药研发均在其资助范围之内。包括RC1、R01、R03、R15、R21(CAN423702及423825除外)、R22、R23、R29、R33、R35、R37、R55、P01、P42、UC1、U19及自1980财政年度至今的MGMSP4l基金； 自1993财政年度至今的UO1基金。不包括NLM 基金、1990财政年度之前的NCRR和1986财政年度的NCNR基金。其中R01：研究计划基金——Research Project Grants，资金下拨到美国国内外各研究机构，资助科学家个人的研究项目，是NIH资助的主要方式。
R01是生命科学和生物医学类的学者关注程度非常高的一类项目，尤其对于美国高校的“青椒”，有时候可以说是“性命攸关”。在很多学校，一个助理教授拿下一个R01项目就能顺利解决升职和终身教席（Promotion and Tenure），由于竞争激烈，现在的R01往往变得难以企及。一个R01项目的资助体量大致是5年100到150万美元左右。这些经费都是给申请人的，主要用于申请人、博士后和研究生的工资（人员费用往往占大头）以及其他科研花费，而学校在该科研经费中的提成由NIH另行给付（按合同规定大约占科研经费额度的40－60%不等）。R01项目在个人和机构科研评价中权重很高，所以即便是拿到了tenure的终身正、副教授们也对它趋之若鹜，事实上大约有半数左右的R01申请者都是正教授。