四川大学华西医院：整合外泌体microRNA信息和电子健康档案用于改善结核病的诊断准确度
结核病（Tuberculosis，TB）在复杂的临床条件下难以被诊断，并且电子健康档案（electronic healthrecords，EHR）通常不足以做出准确的诊断。来自四川大学华西医院李为民课题组、应斌武课题组和加拿大多伦多大学Zhaolei Zhang课题组发布一项研究，他们利用外泌体miRNA信息联合电子健康档案数据能够改善肺结核、结核性脑膜炎等结核病的临床诊断效果。该研究发表于EBioMedicine杂志上（IF 6.183）。
结核病（Tuberculosis，TB）已经超过艾滋病成为最致命的单一因素传染病，这主要是由于早期和明确的诊断以及随后及时治疗的难度很大。在活动性结核病例中，肺结核（PTB）占所有结核病的80％，而结核性脑膜炎（TBM）占所有结核病例的1.6％。然而，TBM是最严重的结核病形式，占结核病相关死亡率的50％。结核病的准确早期诊断仍然具有挑战性，因为结核病的症状和放射学特征与许多其他疾病的症状和放射学特征具有重叠性。目前可用于结核的诊断方法具有固有的局限性，例如孵育时间长（使用基于培养的方法）、经济成本高、医疗条件差（例如GenXpert检测）、灵敏度低等，因此往往不符合临床要求。这些情况迫切需要新的生物标志物或临床方法来改善结核病诊断，特别是在PTB和TBM上。
2014年，世界卫生组织宣布，应该优先考虑基于非痰来源的结核病诊断生物标志物。通过血液转录组学分析报道了许多结核病生物标志物。这些已发表的结核病特征通常由数十个或数百个基因位点组成，这些特征具有合理的诊断价值，但通常昂贵、技术要求高且难以在临床中实施。因此迫切需要具有高诊断准确度的最少的基因位点检测方法。此前研究发现了一种三联基因组（GBP5、DUSP3和KLF2）检测，能有效区分活动性结核与其他疾病，AUC为0.83，然而，他们的数据来自公共GEO数据库，并且没有进行qPCR验证。后来有研究发现了四联基因组（GBP1，ID3，P2RY14和IFITM3）对结核病的诊断潜力，这种4个基因特征在不同的数据库中具有不同的表现（AUC范围为0.58-0.94），而且对肺外结核的检测仍不明确。
目前，外泌体已成为许多疾病中生物标志物的来源。外泌体是从活细胞释放到循环系统中的微囊泡，通常直径为30-100nm并包含有RNA和蛋白质分子。外泌体被认为通过将其货物分子运输和递送至靶细胞而参与细胞间通信和免疫调节。在不同的外泌体货物分子中，microRNA被认为是最有希望的候选生物标志物，因为miRNA在体内高丰度、具有稳定性、易于取样以及可作为所有细胞调节因子。实际上，外泌体miRNA的诊断潜力已成为大量研究的目标，特别是与癌症相关。外泌体miRNA可以通过血脑屏障并且可以进入肺部，因此，外泌体可以从感染部位释放到循环中，并作为病理生理学和潜在生物标记物的可能性。到目前为止，只进行了少数针对外泌体miRNA的结核病研究。有研究人员曾得到结核分枝杆菌（MTB）感染的巨噬细胞分离的外泌体miRNA的差异谱，表明外泌体miRNA在MTB感染期间具有免疫调节和诊断潜力。另外两项研究还表明，外泌体miRNA可能成为区分结核病患者与健康对照或哮喘患者的候选物。然而没有已发表的研究探索外泌体miRNA是否可用于区分结核病与其他具有相似症状的疾病，这比区分结核病与健康对照更具挑战性。此外，没有已发表的研究探索了外泌体miRNA在TBM这种最严重的结核病中的诊断价值。因此，仍然迫切需要对外泌体miRNA作为非侵入性TB生物标志物的潜力进行更系统和全面的研究。
除了探索分子和细胞生物标志物外，研究人员还研究了各种基于电子健康档案（electronic health records，EHR）诊断TBM的分析模型。这种模型的一个例子是Thwaites的越南模型，该模型建立了一个五特征评分方案，其诊断TBM的敏感性为86％，特异性为79％。尽管结果还不错，但这种模型往往难以在不同的人群和环境中实施。据报道，越南模型的特异性在马拉维人群中降至43％，而在中国人群中仅为5％。因此可能需要额外的临床数据或方法来改善当前TB诊断方法。
图：本研究的研究策略模式图
本文中描述的工作包括四个连续步骤，如图所示。在Exploratory Step中，研究人员通过使用微阵列平台鉴定了11种在结核病例（包括PTB和TBM）和健康对照之间显着差异表达的外泌体miRNA。在Selection Step中，通过将PTB / TBM与其各自的对照进行比较并使用qRT-PCR方法，进一步筛选至6个miRNA。在TrainingStep中，通过结合支持向量机机器学习（SVM）模型、外泌体miRNA数据与EHR数据，来区分PTB/ TBM患者与其疾病对照或健康对照。最后，在Testing Step中，研究人员评估了新的PTB / TBM模型的性能。（0.86-1.00），0.89（0.84） -1.00）分别对PTB的敏感性和特异性。此外，据我们所知，这项研究首次表明外泌体miRNA已被证明是TBM疾病的有效生物标志物。
结果发现，六种外泌体miRNA（miR-20a，miR-20b，miR-26a，miR-106a，miR-191和miR-486）在TB患者中差异表达。比较了三种SVM模型，“EHR+miRNA”、“仅miRNA”和“仅EHR”，发现联合“EHR+miRNA”模型比单独使用EHR数据和miRNA数据表现更好，其对TBM的诊断灵敏度为0.94，特异性为0.95。研究结果表明，联合外泌体miRNA和EHR可能有助于改善TBM和PTB的临床诊断准确度。
参考文献：Hu X, Liao S, Bai H, Wu L, Wang M, Wu Q, Zhou J, Jiao L, Chen X,Zhou Y, Lu X, Ying B, Zhang Z, Li W. Integrating exosomal microRNAs andelectronic health data improved tuberculosis diagnosis. EBioMedicine. 2019 Feb7. doi:10.1016/j.ebiom.2019.01.023.
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