电活性微生物膜的形成及其在环境领域的新应用探索
微生物是自然界中分布最广泛、最古老的分解者。它们在地球上繁衍的几十亿年间，创造了丰富多彩的生命形式，也为当今世界废弃物的分解提供了最廉价、最有效的手段。过去的一个世纪中，以活性污泥法为代表的生物处理技术肩负了去除有机污染物的重任，其本质上可认为是人工强化的集中式微生物分解系统。
在这类系统中，氧化还原是主要的化学反应形式。有机污染物被活体微生物代谢、矿化，其中的电子通过一系列的酶促反应最终到达电子受体。在如活性污泥法的好氧处理系统中，通过外源持续曝气供氧，微生物氧化有机物转出的电子通过复杂的呼吸链最终传递给氧，电子传递的过程伴生大量的ATP供给微生物生长和生命活动。
当微生物的生存环境中氧气不足（缺氧）甚至无氧（厌氧）时，具有高氧化还原电位的物质就显得弥足珍贵了。部分微生物进化出了厌氧条件下直接还原自然界铁锰矿物的能力。这些微生物代谢有机物产生的电子可以通过某些特殊通道穿透原本认为绝缘的细胞膜，实现了污染物氧化电子的直接输出。这类微生物我们称之为电活性细菌，而细菌胞外直接电子传递现象的发现为废水废物中回收部分能量、加速污染物降解转化、异位补充电子受体提供了新思路，是近十年来环境工程领域的研究热点。例如，我们从污水中定向富集电活性微生物，并将其作为阳极构建微生物电化学系统（Microbial electrochemical system, MES），可将污染物降解产生的化学能直接转化为电能或其他形式的能量载体（如氢气、甲烷）。今天的微信推送将向大家介绍南开大学研究团队近年来在混菌电活性生物膜的形成过程、快速富集以及微生物电化学原理的拓展应用3方面的研究进展。
微生物可依靠分泌的胞外聚合物（EPS）相互粘结并依附于固体表面，形成生物膜。它是微生物开疆拓土的堡垒，对于种族繁衍具有重要意义。环境中的电活性微生物通常以厌氧生物膜的形式出现。以往的研究发现，用于接种MES的污水、污泥甚至沉积物中，电活性微生物的含量不足1%。而经过3-7天的驯化当系统达到最大输出电流时，以典型的变形菌门产电菌Geobacter为例，其在阳极生物膜中的含量可以达到95%以上。产电菌是如何从复杂的混菌体系中脱颖而出的？又为什么能在阳极上称霸一方？这些问题很有趣，也是该团队重点研究的问题之一。为了原位观察电活性生物膜的成膜过程，我们自主搭建了一套双光源明场生物电化学成像系统（图1)。
图1 双光源明场生物电化学成像系统
以透光的导电玻璃为工作电极、生活污水中的浮游细菌为接种菌源，在同一片电极表面测试并拟合了局部感应电场。发现感应电场强度不同的位置，生物膜的形貌完全不同（图2）：在感应电场最强的中心区域，生物膜呈密实的红色球状（直径约50微米）；而随着感应电场强度减弱，红色球状体逐渐消失，生物膜变为灰黄色。生物膜颜色提供了重要的信息，因为迄今为止发现的绝大多数电活性细菌都是带有颜色（红色）的，这可能是由于其表面分泌大量的传电细胞色素。感应电场越强，生物膜越密实，群落中的电活性微生物越多。不同深度生物覆盖度随电场强度线性增加，感应电场最强的区域几乎贡献了全部的电流。这里由于使用了乙酸钠作为碳源，主要的电活性微生物为Geobacter。对Geobacter群落信息进一步分析表明，G. sulfurreducens和G. anodireducens是占优势的菌种，但二者在梯度感应电场中的分布规律却截然相反：G. sulfurreducens近乎均匀分布，而G. anodireducens却随电场强度升高而增多，表明同属不同种的产电菌对感应电场的响应机制可能是完全不同的。这些结果初步验证了电活性微生物对感应电场是有响应的，且这种响应在种水平存在巨大差异，为进一步揭示电活性细菌定向富集机理提供了思路。
图2 不同感应电场强度下电活性生物膜的形态差异照片(A)和示意图(B)
电活性生物膜的富集时间存在差异，通常需要3~90天不等的启动时间。过长的启动时间限制了其未来在废水处理工程中的应用。为了解决这个问题，我们开发了多种加速电活性细菌筛选、成膜的方法，包括高电位富集、重力沉降加速和信号物质调控。与上文提到的高感应电场选择性富集电活性细菌类似，我们发现当阳极电位恒定在较高的数值时，局部电场增强，污水中电活性微生物的富集时间缩短将近一半。富集完成后，其电活性与常规方法驯化的生物膜相当。进一步对系统进行电量衡算发现，不同的阳极电位掌控着细菌之间的电子分配。换言之，不同电位下微生物消耗有机物产生的电子归宿是不同的。在较高的阳极电位下，流向阴极的电量显著升高；而在较低的阳极电位下，电子会部分流向产甲烷过程、产氢过程，从而造成阴阳极间直接转移电量的下降，库伦效率降低。从电子利用的角度看，较高的阳极电位（即较低的运行电阻）会使MES更加高效，获取的电能也更多。在系统启动初期，重力沉降作用可有效提升阳极表面电活性生物膜的附着速度和输出电流。浮游生长的细菌靠重力作用沉积于电极上，单位生物质的产出电流可由334 ± 5提升至480 ± 8。与未经重力沉积的对照相比，成熟生物膜的厚度增加了46%，电活性也提升了近30 %。重力沉降方法简单易行且能显著提升电活性生物膜的富集速度和电活性（图3）。为加速电活性生物膜形成、提升单位面积的生物电活性，未来或许可考虑在启动初期采用类似SBR的间歇式运行模式。这些研究为大型化MES的快速启动提供了基础数据。
图3 重力沉降加快电活性生物膜形成、提升电活性
与其他细菌相同，电活性细菌的成膜过程受到化学信号物质调控。研究团队发现了一种能够双向调节电活性生物膜形成的信号物质——妥布霉素。它是一种针对革兰氏阴性变形菌的抗生素，先前的研究中已证实其对电活性微生物的抑制作用。但当妥布霉素的浓度降低至抑制浓度以下（亚抑制浓度）时，能显著促进电活性生物膜的形成。亚抑制浓度妥布霉素（1/40和1/80）可作为信号物质促进混菌电活性生物膜的形成，启动时间缩短了9%，电流密度提升了13%。亚抑制浓度妥布霉素选择性提升Geobacter的含量。我们选取模式菌G. sulfurreducens PCA考察了其促进电活性的分子生物学机理。在妥布霉素的刺激下，G. sulfurreducens PCA的生长曲线显著加快，转录组学研究发现该菌所有的细胞色素c相关的基因均显著上调，IV型伞毛的相关基因也上调了。细胞色素c和IV型伞毛是该菌胞外电子传递中最关键的两个物质媒介，二者上调意味着电活性微生物具有更强的电活性。这可能是由于痕量抗生素对电活性细菌产生了胁迫效应，刺激其快速成膜并大量分泌电活性组分以抵抗可能的危险。该浓度的妥布霉素并未引发细菌产生抗性基因。该研究同时揭示了自然界中痕量抗生素对金属还原过程的潜在影响。
图4 亚抑制浓度妥布霉素选择性富集电活性细菌
如上文所述，电活性微生物在降解污染物的同时，可将其中的化学能直接转化为电能或生成氢气甲烷等能量载体。因而MES在污染物能源化领域的潜在应用成为最大的研究热点。然而，微生物电化学技术并不仅限于微生物燃料电池或微生物电解池。电活性微生物独特的胞外电子传递特性构建了细胞活性和电信号之间的天然联系。凡是能影响微生物细胞活性的因素，都能够直接以电流变化的形式反馈。基于此可构建以电活性微生物为敏感元件的广谱型传感器。先前的研究中证实，MES可作为水质毒性预警传感器，不论有机毒物还是重金属均能得到迅速反馈。有机物浓度与微生物活性/产出电流的关系符合莫诺方程，可利用MES传感器实现对水中生化需氧量（BOD）的在线监测。然而这类传感器的最大弊病是，一旦受到环境冲击，其活性难以恢复，成了一次性的“消耗品”。为了增强其稳定性，我们尝试在电活性生物膜的外部包裹一层纳米聚多巴胺层，作为其外部“铠甲”增强对逆境的抵抗能力。实验结果表明，这层约50nm的聚合物薄层“防弹衣”能够有效抵抗极酸的侵蚀，在pH=0.5的极酸冲击（30min）后，生物膜可恢复电活性，而未受保护的生物膜冲击后失去电活性并解体(图5)。
图5 电活性生物膜穿上聚多巴胺“铠甲”抵抗强酸冲击
目前所有的MES传感器均用于水质监测。2018年研究团队发明了一种新型植物-MES传感器，未来有望用于空气污染监测。在这个新的系统中，研究人员将植物（水稻）作为敏感元件，将电活性微生物置于植物根部。实验证明，这种传感器非常灵敏。当酸雨攻击水稻叶片时，叶片受损导致光合活性下降、根际分泌物减少，最终导致根际电活性微生物的底物浓度降低、电流下降，迅速触发预警（图6）。研究发现酸雨激发叶片的信号通过富马酸、半乳糖和葡萄糖通路由叶片经根际传导至微生物预警，响应时间小于2 min，可为农民挽救水稻争取时间，避免酸雨对水稻的进一步侵害。论文被选作ACS Editor’s Choice，并被英国《经济学人（The Economist）》杂志专题报道。
图6 植物-MES酸雨预警传感器
电活性微生物是自然界中一类独特的、具有直接胞外电子传递的生命体，在污染物定向转化和能源化领域具有重要价值。通过监测其成膜过程，研究人员推测它们中有一些可以感知电场、定向聚集，其生物学机理有待进一步深入探索。通过恒定高电位、初期重力沉降和信号物质调控，可显著缩短电活性微生物膜的富集时间，提升其电活性。基于其活性与电信号的直接关系，研究团队构建了新型植物-MES传感器，实现了酸雨的实时预警。团队目前正在开展电活性微生物与反硝化细菌的种间电子传递研究，发现了不可利用硝酸盐的电活性细菌G. sulfurreducens可加速反硝化微生物群落形成、消除迟滞期，减缓亚硝氮积累，加快反硝化速率（图7）。未来有望开发出基于种间电子传递的低碳氮比高效废水脱氮新技术。典型的电活性微生物虽不足百分之一毫米大小，在污染物转化方面却具有惊人的潜力，期待它们为这个世界带来更多的惊喜。
图7 电活性细菌G. sulfurreducens与反硝化细菌互营
参考文献
Wang X,Zhou L, Lu L, Lobo FL, Li N, Wang H, Park J, Ren ZJ*. Alternating current influencesanaerobic electroactive biofilm activity. Environ.Sci. Technol., 2016, 50 (17),9169–9176
Du Q, Mu Q, Cheng T, Li N, Wang X*. Real-time Imaging Revealed That Exoelectrogens fromWastewater Are Selected at the Center of a Gradient Electric Field. Environ. Sci. Technol., 2018, 52, 8939-8946
Wang X, Feng Y*, Ren N, Wang H, Lee H, Li N, Zhao Q. Acceleratedstart-up of two-chambered microbial fuel cells: effect of anodic positivepoised potential. Electrochimica Acta, 2009, 54: 1109-1114
Li T, Zhou L, Qian Y, Wan L, Du Q, Li N, Wang X*. Gravity settling of planktonicbacteria to anodes enhances current production of microbial fuel cells. Appl. Energy, 2017, 198, 261-266
Zhou L, Li T, An J, Liao C, Li N, Wang X*. Subminimal InhibitoryConcentration (Sub-MIC) of Antibiotic Induces Electroactive Biofilm Formationin Bioelectrochemical Systems. Water Res.,2017, 125, 280-287
Du Q, Li T, Li N, Wang X*. Protection of Electroactive Biofilm from Extreme AcidShock by Polydopamine Encapsulation, Environ.Sci. Technol. Lett., 2017, 4, 345-349.
Li T, WangX*, Zhou Q, Liao C, Zhou L, Wan L, An J, Du Q, Li N, Ren ZJ*. Swift AcidRain Sensing by Synergistic Rhizospheric Bioelectrochemical Responses. ACS Sensors, 2018, 3, 1424-1430.
Wan Y, Zhou L, Wang S, Liao C, Li N, Liu W, Wang X*. Syntrophic Growth of Geobacter sulfurreducens Accelerates Anaerobic Denitrification. Front. Microbiol., 2018, 9, 1572
本文总结了南开大学王鑫教授团队的研究成果。王鑫凭借《微生物电化学废水资源化及污染预警技术》获得了2018年度'首创水星奖'前沿科学类二等奖。
“首创水星奖”由国际水协会中国青年委员会（IWA YWP China Chapter）与北京首创股份有限公司联合创立，旨在推进中国水与环境领域青年科技人才开展创新基础研究、核心技术开发与产学研融合，推动并引领水与环境产业技术进步和跨越升级。