T细胞干性和耗竭的分子透视
在慢性抗原刺激（如感染、移植、癌症和自身免疫）过程中，T细胞干性和耗竭作为两个关键的对比现象共存。T细胞干性描述T细胞的干细胞样行为，包括自我更新、多能性和功能持久性。T细胞耗竭是指慢性抗原暴露导致效应器功能逐渐丧失，耗竭的T细胞（TEX）高表达多种抑制性受体，在细胞增殖和细胞因子产生方面表现出严重缺陷。
人们普遍认为，原始T细胞和某些记忆性T细胞亚群具有干细胞样特性。在研究慢性感染和癌症中T细胞的耗竭分化时，最近的研究强调了“耗竭前体”T细胞（TPEX）在最终分化为TEX细胞之前的干性。临床上成功的检查点阻断癌症治疗似乎能激活抗肿瘤TPEX细胞，但不能激活TEX细胞。
因此，了解T细胞干性和耗竭的转录和表观遗传学调控，以及系统免疫学过去和将来如何用于定义TPEX向TEX细胞转化的分子基础，将有助于更好地理解T细胞的干性和耗竭，以开发新的免疫治疗策略。
适应性免疫依赖于在自然急性感染或接种疫苗后创造的免疫记忆。产生长寿命抗原特异性记忆淋巴细胞是免疫记忆的细胞基础，T细胞干性包括T细胞自我更新和分化为多种下游细胞类型的能力，这种能力称为多能性。
对小鼠记忆T细胞的早期研究确定了CD62L+CD44+中枢记忆T（TCM）和CD62L–CD44+效应记忆T（TEM）细胞。TCM细胞的终末分化程度低于TEM细胞。单个原始T细胞和单个TCM细胞在抗原刺激下产生的后代大小和多样性非常相似。此外，来自单个初级TCM细胞的后代含有次级TCM细胞。当次级TCM细胞被单独转移到新宿主并暴露于抗原时，它们再次产生不同的子代细胞，包括效应器T（TEFF）、TCM和TEM细胞。
有一种幼稚的记忆性T细胞群，其分化程度甚至低于TCM细胞。这些细胞被命名为记忆干T细胞（TSCM），TSCM细胞与原始T细胞有许多相似之处，然而，它们是在抗原刺激后表达Bcl-2、Sca-1、IL-2Rβ、CXCR3和CD95水平升高。
TSCM细胞直接从幼稚的T细胞发育而来，IL-7对于体外从幼稚T细胞发育人类TSCM细胞至关重要，而IL-15支持其扩增。许多研究支持了记忆性T细胞分化的渐进模型，遵循原始T细胞→TSCM→TCM→TEM。
PD-1/PD-L1检查点阻断对不同癌症的治疗有效。由于TEX细胞通常表达高水平的PD-1，因此T细胞耗竭的逆转被认为是PD-1/PD-L1阻断的潜在机制。
2016年发现TCF1+PD-1+TPEX细胞后，这一观点发生了巨大变化。研究发现TCF1+PD-1+CD8+T细胞亚群类似于慢性LCMV感染期间的干细胞，经历自我更新，并分化为终末TCF1–PD-1+TEX细胞。TCF1不仅是该细胞亚群的标志物，而且在其产生中也起着重要作用。更重要的是，PD-1阻断后的增殖爆发几乎完全来自该细胞亚群。
TCF1+PD-1+TIL表现出干细胞样功能，因为它们介导了免疫治疗的增殖反应，产生TCF1+PD-1+和分化的TCF1–PD-1+细胞。一项研究通过Tcf7白喉毒素受体（DTR）系统清除肿瘤特异性TCF1+CD8+T细胞，发现TCF1+PD-1+TIL的消除确实限制了免疫治疗的反应。因此，免疫检查点阻断可能是依赖于干细胞样TCF1+PD-1+TIL的增殖，而不是依赖于T细胞耗竭程序的逆转。
随着研究的深入，调节T细胞干性的转录因子逐渐被揭示。转录因子TCF1不仅是记忆T细胞干性的标志物，也是记忆性T细胞干性的关键调节因子。TCF1缺陷小鼠产生正常的主要效应T细胞反应，但在急性感染高峰时，它们基本上缺乏CD8+记忆前体细胞。急性感染后，TCF1缺乏严重损害CD8+TCM的分化、寿命和对抗原的反应。这些发现表明TCF1调控CD8+记忆T细胞的干性和命运。
TCF1也是慢性抗原暴露期间TPEX细胞的标志物和关键调节因子。TCF1缺乏会导致TPEX细胞的产生障碍。此外，Chen等人使用scRNA-seq和谱系追踪研究慢性感染早期的T细胞状态。他们发现TCF1在培养TPEX细胞时抑制KLRG1hi终末效应T细胞的发育。因此，尽管TCF1促进TPEX细胞生成并维持慢性反应，但它可能抑制T细胞发挥直接效应器功能。
转录因子BACH2是CD8+T细胞记忆分化所必需的。研究发现，BACH2与TCR驱动基因的增强子结合，降低了AP-1位点对Jun家族转录因子的可用性，此过程限制终末效应细胞分化。因此，效应T细胞下调BACH2表达以促进效应器命运分化，相比之下，BACH2的表达能够产生长寿命的记忆细胞。
BACH2是慢性抗原暴露期间TPEX细胞的重要调节因子。研究表明BACH2缺乏会损害TCF1+CD8+TPEX细胞的生成，而BACH2过表达会在慢性感染的早期阶段加强其生成。因此，BACH2积极促进对干细胞样CD8+TPEX谱系的生成，并保护TPEX细胞免受终末耗竭。
Id3是负调节DNA结合E蛋白的Id蛋白家族成员，对CD8+记忆性T细胞的形成至关重要。Id3在TCF1+TIM3–TPEX细胞中高度表达。当TPEX细胞最终分化为TIM3+T细胞时，Id3和TCF1逐渐丢失。因此，Id3和TCF1都是TPEX细胞的转录标记。Id3是否调节TPEX细胞状态尚不清楚。
转录因子c-Myb是CD8+T细胞干性的另一个关键调节因子。在抗肿瘤疫苗接种后，Myb缺陷型CD8+T细胞易于终末分化，产生的干细胞样TCM细胞少于Myb充足型T细胞。相反，c-Myb过表达促进CD8+T细胞记忆和回忆反应，从而引发治疗性抗肿瘤免疫。系统免疫学方法进一步表明，在CD8+T细胞中，c-Myb促进TSCM细胞的形成，抑制终末分化，并促进TCF1+TPEX细胞的持久性。
在急性感染时，T细胞经历显著的表观遗传重组以实现多种功能。
DNA甲基化通常会抑制细胞中的基因表达。研究发现，CD8+记忆前体最初获得Dnmt3a依赖的从头开始的DNA甲基化程序，以抑制某些幼稚相关基因的表达，并在效应器相关基因的位点上去甲基化（允许表达）。为了发育成长寿记忆T细胞，这些记忆前体细胞会清除原始相关基因位点的从头甲基化程序，以允许其重新表达，而关键效应基因仍保持去甲基化状态。因此，在记忆细胞发育过程中，T细胞可能丢失并重新表达一些干细胞/幼稚相关基因。充分发育的记忆T细胞表达幼稚的相关基因，并在再次感染时发挥效应器功能。
组蛋白H3赖氨酸9（H3K9）和27（H3K27）的甲基化与转录抑制高度相关。SUV39H1是一种使H3K9甲基化的组蛋白甲基转移酶。研究发现，SUV39H1缺失的CD8+T细胞在终末效应细胞分化期间无法沉默干/记忆基因，并增加了长期记忆重编程能力。
多克隆抑制复合物2（PRC2）通过H3K27的甲基化沉默基因表达。EZH2是PRC2的催化亚单位。EZH2缺乏损害末端效应细胞分化。
近三十年前，Moskophidis等人用LCMV-D感染小鼠，大量LCMV-D的存在产生高抗原负荷，迫使特异性抗病毒CD8+细胞毒性T细胞耗竭。由于当时的技术限制，研究发现了现象，但尚未从分子机制上解释。
如今，系统免疫学方法允许我们超越传统的细胞表面标记物或细胞因子表达，从而使我们能够观察支持各种T细胞状态的转录、表观遗传学和代谢编程。2007年，Wherry等人使用微阵列分析研究慢性LCMV感染后CD8+T细胞衰竭的分子特征。发现CD8+TEX细胞过度表达PD-1和其他抑制性受体，表达一组独特的转录因子，并存在严重的代谢和生物能量缺陷。这些发现首次揭示了TEX细胞如何在分子水平上逐渐失去效应器功能。
ScRNA-seq技术为研究T细胞生物学开辟了新的领域。许多最初的scRNA-seq研究检测了不同类型癌症中的T细胞状态，CD8+TEX细胞通常优先富集在肿瘤微环境中。从那时起，T细胞耗竭已成为一个公认的术语，用来描述T细胞对慢性感染和癌症的反应。
T细胞耗竭发生在慢性抗原刺激期间，高抗原负荷导致T细胞衰竭。高抗原负荷不仅维持抗原的慢性刺激，而且还可通过TCR提供重复的抗原刺激。
TCR诱导的信号激活NFAT转录因子家族，活化的NFAT蛋白反过来与其他转录因子（如AP-1家族）相互作用，以控制T细胞活化和效应细胞分化。缺乏NFAT的CD8+T细胞不能表达耗竭相关抑制受体。
TOX是由NFAT启动诱导的次级转录因子。TOX可能不参与急性感染时效应和记忆T细胞状态的分化。相反，在慢性感染和癌症中，TOX是CD8+T细胞耗竭程序的关键驱动因素。研究发现，TOX表达对TCF1+TPEX细胞的形成和维持以及随后的终末TEX细胞分化至关重要。没有TOX，TPEX细胞形成受损，TEX细胞无法形成。Tox缺陷的CD8+细胞不上调抑制性受体的基因，如Pdcd1、Entpd1、Havcr2、Cd244和Tigit。
NR4As（NR4A1、NR4A2和NR4A3）也是启动NFAT诱导的次级转录因子。在慢性病毒感染或肿瘤中，CD8+T细胞表达高水平的NR4As，NR4As在T细胞功能障碍/耗竭程序中起着重要作用。剔除CAR-T细胞中的所有三种NR4A可促进肿瘤消退并延长荷瘤小鼠的生存期。
BATF是AP-1家族转录因子的成员。它与JunB形成二聚体，在活化的T细胞中作为AP-1活性的阻遏物。有人认为BATF是耗竭驱动因素之一，BATF表达升高与HIV感染时CD8+T细胞耗竭相关。沉默T细胞中的BATF可以拯救HIV特异性T细胞功能。
BATF、BACH2和NR4A1都对AP-1活性具有抑制作用。BACH2抑制AP-1依赖性效应基因以维持TPEX细胞，而BATF和NR4A1促进终末耗竭。总之，TCR-NFAT-TOX/NR4A轴驱动CD8+T细胞的耗竭程序。
耗竭T细胞的表观遗传学特征与效应和记忆T细胞的表观遗传学特征明显不同。Sen等人使用ATAC-seq定义CD8+T细胞中的染色质可及区（CHAR）。TEX细胞与效应/记忆T细胞相比，在耗竭相关基因（如Pdcd1、Havcr2、Batf）附近表现出更高的ChARs峰值强度。
此外，研究发现，在LCMV-Cl13感染后，抗原特异性T细胞获得不同于效应和记忆T细胞的耗竭相关表观遗传学特征。虽然PD-L1阻断可重新激活T细胞对LCMV-Cl13的反应，但它在很大程度上无法重塑耗竭相关的表观遗传学特征。因此得出结论，TEX细胞的表观遗传稳定性限制了PD-L1阻断效应的持久性。
另一项研究表明，通过药物调节的degron系统在CAR-T细胞中诱导短暂休息后，耗竭的CAR-T细胞可以发生表观遗传重塑。四天诱导可使耗竭的CAR-T细胞的表观遗传图谱类似于未耗竭的对照CAR-T细胞。重要的是，短暂休息可以恢复耗竭CAR-T细胞的抗肿瘤功能。总之，TEX细胞具有不同于效应和记忆T细胞的表观遗传学特征。耗竭相关表观遗传状态的稳定性在耗竭的CAR-T细胞中可能不同于TEX细胞。
解剖位置和与抗原的可及程度决定了T细胞的状态。例如，在慢性病毒感染研究中，更多终末分化的TEX细胞存在于脾脏的红髓中，而脾脏是LCMV感染的主要部位。分化程度较低的TPEX细胞主要定位于白髓的T细胞区。
环境是否通过配体结合、营养素利用率和局部细胞因子产生指示T细胞状态？抗原丰度是否由于邻近而导致过度TCR刺激，从而导致终末效应器分化或耗竭？这些问题仍有待回答。然而，不可否认的是，环境因素在决定T细胞状态中起着极为重要的作用。组织环境可能是改善或抑制T细胞功能的有吸引力的靶点。
例如，在肿瘤微环境中，癌细胞坏死引起的细胞外钾升高抑制TCR驱动的Akt-mTOR磷酸化和TIL效应器功能。这种抑制作用取决于丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP2A的活性。其他局部免疫细胞也会改变肿瘤微环境，从而改变T细胞反应。例如，肿瘤相关巨噬细胞可以分泌内源性糖皮质激素，这会下调效应器功能，导致T细胞功能障碍和检查点阻断反应差。肿瘤微环境中的M2样抑制性巨噬细胞与耗竭的EOMEShiCD8+T细胞形成双向抑制性相互作用，导致更差的临床结果。
在过去的几十年中，我们对T细胞干性和耗竭的转录、表观遗传学和代谢调节的理解取得了巨大的进展。这些关于各种T细胞状态及其调节因子的令人振奋的新发现可能会让我们深入了解如何找到免疫治疗的切入点。随着更多的机制被揭示出来，找到调节TPEX和TEX细胞命运和功能的方法，将有可能可以彻底改变目前肿瘤免疫治疗的局面。
参考文献：
1.Schrödinger’s T Cells: Molecular InsightsInto Stemness and Exhaustion. Front Immunol. 2021; 12: 725618.