CO-IP结果解读

蛋白参与的交互作用，都会用到一个共同的实验原理，叫免疫共沉淀（Immunoprecipitation），即用一个蛋白的特异性抗体去沉淀这个蛋白，与它存在结合的其他分子会被一起沉淀下来，接下来对沉淀物里的其他分子进行鉴定，核酸就用测序，蛋白就用质谱，就能分析得到与特定蛋白存在交互的其他分子。

理解了co-IP，ChIP和RIP是类似的原理，只是沉淀下来的物质一个是DNA，另一个是RNA。

如果A和B两个蛋白存在交互，我用A的抗体拉A，理论上就应该能在沉淀物中检测到B（用WB的方法）。反过来，如果我用B的抗体拉B，也应该在沉淀物中检测到A，两个分子相互拉都能检测到对方，才能严谨的得出两者有交互的研究结论。所以解读co-IP的实验结果最关键的信息就在于用一个蛋白免疫沉淀的样品（IP）里，有没有另一个蛋白的信号，有条带就是有交互，没条带就是没交互。

在上图的co-IP典型结果里，input是细胞裂解液，里面什么都有，所以用A、B抗体去检测都有信号。IgG是跟抗体类似的但没有特异性结合的蛋白，用IgG去免疫沉淀，不会沉淀到A和B，是体系的阴性对照。而关键的实验结果是关注用A的抗体（anti-A）去免疫沉淀获得的样品里面有B的存在（上半图），或者用B的抗体（anti-B）去免疫沉淀获得的样品里面有A的存在（下半图），即红色箭头标注的组别有条带，就说明A和B之间存在结合。

当然，用A的抗体沉淀下来的样品中去检测A，必然是存在阳性信号的，这也可以看作是实验的阳性对照，如果用A抗体拉A都检测不到，那么体系就有问题了，不可能有B的信号，即使有也是假阳性。

还有一种情况叫外源co-IP，相对于目的细胞里面自身有A和B的内源表达和自然结合，外源co-IP是在工具细胞293中人为地制造A和B的过表达。

这样单独表达A或者单独表达B的分组里，是不存在成功的交互结果的，只有同时转染A和B的分组里，才有类似于内源的用A抗体拉到B和用B抗体拉到A的结果。

之所以会有外源co-IP是因为一个蛋白的特异性抗体也挺贵的，而我们没法一下子就猜对一组交互，还需要多个蛋白反复验证，这时候抗体费用算是不小的负担。外源表达的A和B可以接上蛋白标签，比如Flag，His，HA等，这样用标签抗体结合融合表达了标签的目的蛋白，可以用一组两个抗体，验证所有可能结合的交互蛋白分子，非常有效率。外源验证成功的两个分子组合，再去内源验证。