Cas9敲除小鼠构建之体外转录步骤

1.首先，转录序列预先构建于T7启动子载体质粒，转录模板设计一般要求如下：
（1）在基因组全长克隆过程中，在正向引物的5’端添加T7启动子序列；
（2）以T7启动子作为体外转录启动子，一般启动子后面靶位序列连续带有3个G,转录效率最高；
（3）在正向引物5’端添加一个帽子G,有利于提高体外转录RNA分子的侵染活性。

2. 将含有T7启动子载体质粒进行酶切，获得线性化质粒；
（1）线性化T7质粒：
酶切体系：
10µg  T7 质粒
10µl   10 X M buffer
5µl    DraI酶(15U/ µl)
按照体系加入试剂，轻轻混匀，瞬时离心。然后置于37度水浴孵育3小时，孵育过程中间隔震荡一下，以便充分酶切。

（2）酶切后，取2 µl 产物于1%琼脂糖凝胶电泳，验证质粒是否线性化，可加入原始质粒作为参照，一般线性化质粒为两条带，原始质粒为三条带。不需要将线性化质粒进行胶回收。

（3）直接在酶切产物内加入4 µl RNA保护剂，60度孵育10分钟。

（4）用MinElute PCR Purification Kit纯化试剂盒按说明书回收酶切产物，最后加入10 µl Rnase-free water进行溶解。

（5）NanoDrop测回收的线性化载体浓度。

3.体外转录，选用MEGAshortscript™ Kit试剂盒。
（1）体外转录：将回收的线性化载体进行转录。
体外转录体系：
4 µl 线性化质粒模板(至少2 µg)
1 μL T7 10X Reaction Buffer
1 μL T7 ATP Solution (75 mM)
1 μL T7 CTP Solution (75 mM)
1 μL T7 GTP Solution (75 mM)
1 μL T7 UTP Solution (75 mM)
1 μL T7 Enzyme Mix    

按照上述体系加入试剂（共10 µl），注意在操作过程中将全部试剂至于冰上，依次加入试剂，最后加入T7转录酶。试剂全部加入后，轻轻混匀，将EP管瞬时离心。然后置于37度水浴孵育4-6小时。

（2）转录结束后，向试剂内加入1 μL TURBO DNase ，置于37度水浴孵育 15分钟，以便移除DNA模板。

（3）转录产物选用MEGAclear™ Kit按说明书纯化回收，最后加入30 μLRNase free water进行溶解。

（4）NanoDrop测转转录后mRNA浓度。可配置1% 琼脂糖凝胶电泳180 V 10 分钟，以验证转录后mRNA条带。

（5）分装，冻存于-80度冰箱。注意mRNA易降解，存储时选择小体积冻存，按需取用，取用时置于冰上。

体外转录的操作就介绍到这里了，从上述介绍不难发现整个过程需要用到多个试剂盒，在操作过程中也一定注意无RNA酶操作。同时最好全程将试剂至于冰上，防止降解。