【排斥相关】非HLA抗体在肾脏移植中的作用
抗体介导的排斥反应（AMR）是肾移植术后影响移植肾功能的常见并发症，并阻碍移植肾长期存活。肾脏移植物体液免疫的主要靶点是多态性的HLA抗原，然而有研究发现，在AMR过程中存在直接针对非HLA抗原的抗体。最令人信服的证据来源于针对同卵双生子肾脏移植的研究，该研究发现，同卵双生子肾移植受者仍可发生AMR。与之类似，有研究显示，针对非HLA抗原的免疫反应与较差的移植物长期存活率密切相关。有两个应用独立数据的多中心研究，针对HLA半相合的亲属移植研究后发现，受者如果术前存在细胞毒抗体，则移植后移植物远期存活率将降低。这一发现说明非HLA免疫在移植物慢性排斥过程中也发挥着重要作用。
在对移植物免疫反应过程中出现的自身抗体，其特异性多种多样。值得关注的是，尽管伴随器官移植会产生诸多自身抗体，但大部分移植患者并未出现排斥反应或移植物功能障碍。此现象说明，自身抗体的致病性也取决于其他因素诸如配体的表达、缺血再灌注损伤和/或移植物微环境的炎症状态。对于器官移植受者发生的非HLA抗体介导的移植物排异反应，鉴定出免疫反应的表型、并对此类排斥反应制定针对性的策略，将显著提高移植物及移植受者的存活率。
一、血管紧张素1类受体
（1）血管紧张素1类受体在肾脏移植中的临床研究
血管紧张素1类受体（AT1R）是一类表达于内皮细胞表面的G-蛋白耦联受体，可与血管紧张素Ⅱ结合并调节水-盐平衡及血压。AT1R的过度活动将导致高血压、血管收缩及血管平滑肌增殖。
AT1R抗体首先在导致母体及胎儿致病致死的先兆子痫中被发现。
在肾移植领域有学者第一次报道，在严重的耐激素型血管性排斥及恶性高血压的肾移植患者中，HLA供体特异性抗体（HLA-DSA）检测为阴性，但AT1R抗体水平显著升高。在该研究中，13例患者DSA阳性，而其余20例患者DSA阴性。在DSA阴性的患者群中，有16例患者AT1R抗体阳性并表现为血管损伤和恶性高血压。尽管AT1R抗体是IgG1和IgG3，但抗AT1R阳性并出现血管性排斥患者的移植物活检并未发现补体沉积的证据。与标准的抗排斥治疗方案相比，对AT1R抗体阳性的患者给予血浆置换、静脉注射免疫球蛋白及氯沙坦等综合治疗，可显著改善移植物存活率。此结果说明AT1R抗体可介导血管损伤。
随后的研究证实了这个初始发现，显示AT1R抗体与AMR发生率升高及移植物功能损害密切相关。例如，在一项针对97例HLA-DSA阴性或MICA-DSA阴性的肾移植患者的研究中发现，AT1R抗体及AMR的发病率呈很强的相关性。研究者发现，在诊断为AMR并且移植术前及发生排斥时AT1R抗体阳性（＞17U/ml）的7例患者中，有6例患者AT1R抗体强度与AMR呈正相关。而诊断为急性细胞性排斥反应的9例患者发生排斥时AT1R抗体阴性。值得关注的是，6例AT1R阳性的AMR患者中，仅有1例移植物活检表现为C4d阳性，再次说明非补体依赖途径介导了移植物损伤。
Giral等报道，599例肾移植受者中超过45%的受者移植术前AT1R抗体＞10U/ml。AT1R抗体阳性与移植术后4个月之内的急性排斥反应呈正相关，而且移植术后3年以上的移植物失功风险上升了2.6倍，说明AT1R抗体可能影响移植物长期存活。
在一项针对351例连续肾移植病例有关移植术前及术后AT1R抗体的研究，设定AT1R的临界值为15U/ml，研究显示，有35例受者移植术前AT1R抗体阳性，但术后转为阴性，未对移植物存活产生影响。相反，25例受者中有12例（48%）术前及术后AT1R抗体均为阳性，11例中有7例（64%）移植后出现新生AT1R抗体，而这些患者出现了移植物失功。而且与单纯HLA-DSA阳性的患者相比，AT1R抗体和HLA-DSA均阳性的患者移植物存活率更低，说明AT1R抗体与HLA抗体可能存在协同作用。
诸多研究报道的移植术前AT1R抗体的阳性率较高，但变异较大，从17%至59%不等，变异度较大的可能原因是检测AT1R抗体的方法不同且设定的临界值不同。
（2）血管紧张素1类受体介导损伤的机制
尽管肾移植中发现的AT1R抗体被鉴定为IgG1和IgG3亚型，但C4d沉积只在少部分肾移植患者中存在，说明此类抗体的致病作用包含非补体依赖途径。Dragun等研究显示，抗体与AT1R结合后，会模仿血管紧张素Ⅱ的活性并促进细胞外信号调节激酶的磷酸化以及激活内皮细胞和平滑肌细胞中的转录因子AP-1和NF-κβ。在大鼠移植模型中，过继输注激动性AT1R抗体可以导致高血压病诱发移植物血管改变：包括动脉内膜炎及血管内浸润。综合这些临床和实验数据支持如下假设：与AT1R相结合的自身抗体可通过模拟血管紧张素Ⅱ的活化从而对排斥反应产生影响。
尽管血管紧张素Ⅱ可与AT1R细胞外环路及跨膜螺旋的靶点结合，但AT1R抗体参与移植肾排斥的机制被认为与表达于AT1R细胞外第二环路（ECL2）中的AFJYESQ和ENTNIT抗原表位有关。针对大鼠的分子动力学研究显示，ECL2是AT1R结构的重要组成部分，因而在抗原受体中具有不同的功能状态。与血管紧张素Ⅱ结合状态及氯沙坦结合状态激活AT1R的机制不同，AT1R抗体可直接作用于ECL2并使抗原受体处于持续激活状态。
如上文提及，肾移植前存在的AT1R抗体是血管性排斥反应及恶性高血压的危险因素。然而并非所有出现AT1R抗体的肾移植受者都会出现移植物排斥，意味着可能需要某些辅助因素或环境条件来促进排斥反应的发生。例如，在大鼠缺血再灌注损伤（IRI）模型中，AT1R抗体只有在缺血条件下才能介导肾脏血管收缩。另外，从发生移植肾血管性排斥的HLA-DSA阴性的受者血清分离出的AT1R抗体可诱导移植肾动脉的强烈收缩，但其并不能诱导受者自身动脉的收缩。这些研究结果均支持如下假设：IRI介导的内皮调节AT1R表达和/或AT1R结构的破坏为AT1R与AT1R抗体间的相互作用提供了条件。而有研究发现IRI可导致一些新抗原的暴露，这些暴露的抗原可成为自然抗体的靶点，这一发现也证实了如上假设。
二、基底膜聚糖
（1）基底膜聚糖在肾移植中的临床研究
基底膜聚糖是硫酸乙酰肝素蛋白多糖的一种，是血管壁的重要组分。研究发现，基底膜聚糖的羧基域-血管生成抑制剂，具有抗血管生成特性并含有三个层黏连蛋白样区（LG）。绝大部分抗血管生成剂的抗血管生成活性位于LG3子域。凋亡的内皮细胞可释放组织蛋白酶-L，后者可将LG3子域从基底膜聚糖的羧基域中分离出来。有研究发现肾移植受者血清LG3水平升高与免疫因素介导的血管损伤及移植肾功能不全显著相关。另有研究发现，诊断为BanffⅡ级或Ⅲ级的急性血管性排斥的肾移植患者血清LG3水平较BanffⅠ级小管间质性排斥或移植肾功能正常患者血清LG3水平显著升高。
一个重要的问题是，LG3是否可作为一个新抗原诱导产生LG3抗体从而加速排斥反应的进程。Cardinal等报道，与未发生移植肾排斥反应的受者相比，发生急性血管性排斥的肾移植患者术前和术后血清LG3抗体IgG1及IgG3亚型水平显著升高。且移植术前LG3抗体水平升高可以用来鉴别高风险血管性排斥的受者。单独的移植术前HLA-DSA阳性或移植后LG3抗体水平升高均不能降低发生血管性排斥的移植物存活率，然而，移植术前HLA-DSA阳性伴随移植术后高水平LG3抗体可显著降低移植物1年存活率。该结果提示，与AT1R抗体类似，HLA-DSA和LG3抗体在介导血管内皮细胞损伤及移植物损伤方面具有协同作用。
（2）基底膜聚糖的损伤机制
目前对于基底膜聚糖诱导移植物损伤被认为是通过两个不同的却又相互作用的机制所实现。其一是基底膜聚糖生物活性改变，促进供者血管平滑肌细胞或受者来源的间充质细胞迁移，从而直接导致血管损伤及新生内膜形成。其二为诱导体液性免疫应答从而加速免疫因素介导的血管损伤和血管重塑。
Hebert的研究为这两个机制提供了证据。首先他们发现在小鼠血管性排斥的动物模型中，输注抗LG3的IgG抗体在缺血性移植动脉中能够显著增加T细胞和自然杀伤细胞的浸润、C4d的沉积及血管重塑，而在临近的非缺血性自体动脉中却无上述表现。其次，研究显示小鼠大动脉移植模型中，LG3水平升高可显著加速血管内膜增生。为了进一步阐释LG3如何导致血管重塑，研究者在小鼠大动脉移植模型中应用了重组LG3。研究发现，注射LG3可通过细胞外信号调节激酶依赖途径加强血管平滑肌细胞迁移及内膜增生。而且，注射LG3能够促进移植受者来源的间充质干细胞和平滑肌细胞在新生内膜处的聚集，这个途径依赖于间充质干细胞中整合蛋白α2β1的表达。上述发现均提示，LG3可通过刺激自身抗体表达和/或促进血管平滑肌细胞和间充质干细胞的迁移导致血管损伤及新生内膜形成。
三、自身抗体
器官移植中自身抗体的产生依赖于多种因素。IRI介导的移植物损伤、同种异体免疫及慢性炎症均可导致细胞内蛋白表达于凋亡细胞表面，从而使这些细胞作为自身抗原成为可能。在细胞外囊泡或第三淋巴组织存在的情况下，自身抗原可被移植供者或受者的抗原提呈细胞（APCs）提呈给自身反应性T或B淋巴细胞。进一步了解自身抗体的产生机制，将有助于研发新的治疗方案用以预防及控制移植物排斥反应和异常血管重塑。
（1）缺血再灌注损伤（IRI）
器官移植不可避免地经历不同程度的外科创伤、组织破坏及缺血再灌注损伤，而这些损伤均会促进固有炎症反应，从而导致对移植物同种异体及自身免疫反应。尽管免疫系统环节中具有诸多检查点以保持对自身抗原的中心耐受及外周耐受，但检查点的缺陷及自身抗原的持续存在将导致慢性炎症反应的出现。IRI是一个复杂的病理生理过程，包括活性氧的产生、补体活化、凝血、内皮细胞活化和白细胞招募等过程。IRI引起的组织损伤会导致急性肾损伤和移植物功能延迟恢复，并降低移植物存活。IRI引起的凋亡及坏死可导致损伤相关分子释放，包括自身核酸、组蛋白、高迁移率族蛋白B1等。损伤相关分子可以与模式识别受体相互作用，这些模式识别受体包括表达于髓性细胞、树突状细胞、血管内皮细胞及肾小管上皮细胞表面的Toll样受体2（TLR2）及Toll样受体4（TLR4）。阻断TLR可引起髓样分化因子88（MyD88）的招募及核转录因子NF-κB的释放，此序贯过程将导致前炎性细胞因子的释放，包括IL-1β、IL-6和TNF等，进而促进获得性免疫反应，加速移植物损伤和自身抗原的暴露。
研究证实IRI在缺乏同种异体免疫的情况下足以诱导自身免疫反应。IRI、自然抗体、HLA-DSA及补体均可破坏血管内皮，进而导致坏死及凋亡细胞释放自身抗原。IRI过程中，从损伤的移植物中释放的自身抗原诸如波形蛋白、基底膜聚糖及胶原蛋白V可被抗原提呈细胞加工并提呈给自身反应性T淋巴细胞。循环中的B淋巴细胞与这些自身抗原结合并被自身反应性T淋巴细胞激活进而分泌自身反应性抗体。此外，在器官移植中，补体激活可促进自身反应性抗体的产生。
（2）同种异体免疫与自身免疫之间的相互作用
对移植器官或组织产生的同种异体免疫反应通过直接、间接及半直接途径而实现。一旦这个过程启动，间接异体反应可以扩展至初始靶抗原的其他决定簇，这个过程即分子表位扩展。这种同种异体反应性T细胞通过间接异体识别途径对供者来源的MHC抗原识别的扩展，与慢性排斥反应具有相关性，并与DSA的产生有关。
与之相似，间接识别途径可促进自身反应性T及B淋巴细胞的发展并对移植物排斥产生作用。器官移植后间接异体免疫反应触发自身免疫可能通过抗原模拟自身抗原多肽及供者MHC多肽而实现。异体免疫反应后会出现克隆增殖的T淋巴细胞，一旦这些细胞被激活，将诱导出现移植物的同种异体排斥反应。另一种可能是，针对供者HLA抗原的异体免疫反应引起的组织破坏，可以导致隐蔽自身抗原的释放，促进自身隐蔽抗原决定簇的抗原提呈，从而在移植物组织内诱发自身免疫反应。
（3）细胞外囊泡
通过胞外囊泡建立的细胞间的相互联系逐渐被认为是引起自身免疫及异体免疫的机制。由于胞外囊泡来源于细胞，因此其包含mRNA、miRNA、DNA、蛋白质、脂类、碳水化合物等，并能够正向及负向调节免疫反应。
根据来源不同，胞外囊泡可分为三大类：外泌体、细胞膜微粒及凋亡小体，所有胞外囊泡均含有大量自身抗原。抗原提呈细胞释放的胞外小体也携带表面MHCⅠ类及Ⅱ类分子，并能激活T淋巴细胞。尽管高浓度的外泌体可以直接激活T淋巴细胞，但由于缺乏共刺激分子，外泌体的抗原提呈效率较专业的抗原提呈细胞低得多。相反，当外泌体与树突状细胞相互作用时，可高效地激活T淋巴细胞。
（4）TH17细胞及第三淋巴组织
TH17细胞是分泌IL-17的主要细胞，并参与多种自身免疫性疾病。被TGF-β和IL-6所激活的TH17细胞可强有力地诱导白细胞招募及介导对外源性病原体的免疫反应，然而被IL-23所激活的TH17细胞能够加速组织炎症及自身免疫反应。
有研究报道，移植肾慢性排斥反应过程中第三淋巴组织（TLT）的出现。TLT通过淋巴组织新生过程出现于慢性炎症反应中。在某些自身免疫性疾病中，TLT能够支持自身反应性B淋巴细胞的增殖及成熟。Hsu等研究发现，在小鼠自身免疫性疾病模型中，TH17通过分泌IL-17促进自身反应性生发中心的有序形成。与此类似，将TH17细胞输注给T淋巴细胞缺陷的小鼠，将诱导向自身免疫反应方向的优先类型转换及生发中心的形成，而类型转换依赖于TH17细胞分泌的IL-21。
鉴于TH17细胞具有高水平克隆增殖特性，与TH1细胞相比，其对同源B淋巴细胞具有更强的辅助功能。联合B淋巴细胞囊泡和诱导型T细胞辅助刺激因子的表达，这个过程对于T细胞依赖性抗体的产生至关重要。由于持续分泌BAFF和IL-21，可促进B细胞的存活，因此自身反应性B淋巴细胞在第三淋巴组织中可逃脱过凋亡指令和阴性选择。而且在促炎因子存在的条件下，组织损伤所释放的新抗原可被缺陷的淋巴引流系统捕获，并可不断支持第三淋巴组织的形成。以上研究结果说明TH17细胞对于B淋巴细胞分化及抗体产生具有重要意义。
四、结论及展望
自身免疫在实体器官移植排斥反应中发挥着重要作用。自身抗体的产生可能通过多种机制而实现。
至今对于非HLA抗体引起的免疫致敏临床上尚无公认的脱敏疗法。对于自身抗体导致的AMR的治疗策略与HLA抗体导致的AMR的治疗类似，包括抗体清除、B细胞清除、静脉注射免疫球蛋白、蛋白酶体抑制剂及补体抑制剂。然而这些疗法单独使用还是联合使用效果更佳尚不清楚。未来需要更多的研究来阐明自身抗体的致病机制以及探索更有效的治疗方案。在一项针对去抗体治疗抵抗的前期研究中，发现IL-6抑制剂塔西单抗对于HLA-DSA的治疗具有潜在价值。针对IL-17通路、miRNA和外泌体调节方面的治疗方法有望成为逆转自身抗体介导的AMR及改善移植物存活的有效策略。
由于我们对器官移植中自身抗原如何引起免疫反应的机制知之甚少，限制了我们对抗体介导排斥反应的诊断及治疗。现代基因组学及蛋白质组学研究平台为检测抗体谱提供了新工具，不断发现的新靶点有助于了解自身抗体的致病机制，并为提高移植物的长期存活提供有效策略。
本文摘自《非HLA抗体在肾脏移植中作用的研究进展》，仅供学习交流，完整准确内容请查阅原文。
原文作者：杨关印，连鑫，周洪澜，傅耀文，高宝山
作者单位：吉林大学第一医院
原文来源：《中国免疫学杂志》 2018年第34卷第8期