科研 | 轻、中度慢性阻塞性肺疾病的肺部微生物群
本文由李鸥编译，董小橙、江舜尧编辑。
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导读
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的肺微生物群中经常发现口腔分类群，但尚不清楚这是否是由于吸入的生理过程或标本采集时实验污染所致。因此本研究选取9例轻度或中度慢性阻塞性肺疾病患者，在肺叶切除术中对肺组织和上气道部位进行拭子取样。结果发现链球菌是口腔、支气管和肺组织标本中最常见的菌属，上气道和下气道均有多个分类群。每个受试者自身的支气管和肺组织微生物群之间的相似性大于两个不同受试者的支气管和肺组织微生物群之间的相似性，表明在这两个部位，受试者内部的相似性大于受试者之间的相似性。所有受试者样本的主坐标分析表明，聚类是通过解剖取样部位而不是按受试者分类的。SourceTracker分析发现肺组织菌群来源：21.1%来源于口腔菌群，8.7%来源于鼻腔菌群，70.1%未知。本研究首次评估了不存在上气道污染的轻度-中度COPD肺组织微生物群。这个对COPD患者的小范围研究发现肺部组织微生物群中存在口腔和鼻腔细菌，证实吸入是肺部微生物群的来源之一。
论文ID
原名：The lung tissue microbiota of mild and moderate chronic obstructive pulmonary disease
译名：轻度和中度慢性阻塞性肺疾病的肺部微生物群
期刊：Microbiome
IF：9.133
发表时间：2018年
通信作者：Alexa A. Pragman
通信作者单位：University of Minnesota and Minneapolis Veterans Affairs Medical Center
背 景
高通量测序技术彻底改变了肺微生物群的研究，使人们认识到健康的肺不是无菌的；相反，他拥有复杂的微生物群。目前已开展了针对健康个体和慢性肺脏疾病的肺部微生物研究。这些研究利用通过上呼吸道获得的样本，如诱导痰，支气管肺泡灌洗液和气管内吸出物，发现在下呼吸道分泌物中可鉴定出口腔细菌。但这些研究不能排除所发现的口腔细菌是支气管镜通过口腔插入过程中污染引起的。对COPD患者的肺部微生物群的研究也发现了口腔细菌，对中度或重度COPD患者支气管肺泡灌洗液分析，相对于健康人群，COPD患者可能含有更多的口腔细菌。这些研究支持这样的假设，即在肺微生物群中发现的口腔细菌很可能是口腔分泌物吸入的结果，而不是支气管镜检查期间经口腔污染的。
口腔细菌的吸入是肺微生物群最可能的来源，因为口腔和肺是直接连续的并且口腔富含微生物。而COPD患者是因为喉部敏感性下降、吞咽和呼吸的协调性差，易产生误吸。此外气道粘膜纤毛功能受损导致气道清除率降低。因此，COPD患者可能比健康患者暴露于更多的口腔细菌。肺微生物群可能是口腔细菌播种，然后口腔细菌在肺中增殖；或者肺微生物群可以通过反复吸入口腔细菌维持，而没有增殖。后者即是Dickson等人提出的肺生物地理学的适应岛模型。
为避免在COPD肺微生物群中发现的口腔分类群是样本污染而不是误吸的结果，本研究以手术方式对轻度或中度COPD肺组织微生物群进行取样，无需将样本通过口咽，并避免潜在的上呼吸道污染肺部样本。证明口腔微生物是COPD肺微生物群的真正组成部分，暗示吸入是COPD患者潜在的致病机制。假设口腔细菌是早期COPD肺微生物群的真正成员，并表现出生态漂移。
实验方法
1 纳入病例
疑似或确诊肺癌的患者需接受肺叶切除术的患者纳入该研究。纳入标准如下：（1）接受临床指征的肺叶切除术，（2）年龄≥40岁，（3）通过GOLD标准诊断为轻-中度COPD（FEV1/ FVC <70％），（4）至少有每年10包的吸烟史。排除标准如下：（1）最近2个月内使用抗生素或口服皮质类固醇激素，（2）哮喘病史，（3）在影像学检查或手术中注意到支气管内病变和/或肺叶不张，或（4）在插管过程中观察到吸入。
2 样本采集
纳入病例为手术中确诊为恶性肿瘤且接受肺叶切除术的患者。肺叶切除后，将肺叶置于无菌盆中，使用无菌拭子对主要支气管气道和健康外周肺组织的肺泡表面进行取样。每个病例分别采集口腔、鼻腔、气管和肺组织四个部位的样本。将拭子置于无菌的无DNA管中并在-80℃冷冻直至DNA提取。为评估试剂和设备的DNA污染，采集了6个由未使用的拭子组成的样本作为阴性对照，提取、测序并与实验样品一起分析。
3 DNA提取和16S rRNA基因测序
使用化学和机械裂解法从拭子中提取DNA。如Bartram报道的那样，使用引物通过PCR扩增产生16S rRNA基因高变区3（V3）扩增子。使用明尼苏达大学基因组学中心的配对末端读数，在Illumina MiSeq仪器上对扩增子进行测序。使用在琼脂糖凝胶电泳上产生可见条带所需的最小PCR循环数（≤35）进行PCR扩增样品。在所有情况下，对照样品在琼脂糖凝胶电泳上不产生可见条带。
4 定量PCR
为了确定每个样品的16S rRNA基因拷贝数，使用16S rRNA qPCR引物在终浓度为0.3μmol/L的条件下36个样品进行定量PCR。根据试剂盒的规格（95℃1分钟，55℃30秒，95℃30秒）进行循环条件，然后进行熔解曲线。
5 数据处理
使用Trimmomatic修剪配对末端reads，使用PANDAseq组装，并将得到的序列使用QIIME进行过滤，去噪，和去除嵌合体。利用Greengenes（版本13_8）结合ninja_ops 进行closed-reference OUT聚类，完成具有97％相似的OTU选择，然后对未匹配reads 进行de nove 聚类。全数据集采用Bray-Curtis距离进行β多样性分析。对照组只有一个分类群（乳杆菌）存在于阴性对照样品中并且在受试者样品中以> 1％的相对丰度存在。因此，删除该分类单元。这个纯化后的数据集进行了α多样性计算，SourceTracker分析，使用Greengenes（13_8）的分类学分类和排列测试。使用β-多样性数据集（使用Bray-Curtis距离）进行主坐标分析（PCoA）和PerMOVOVA。中性理论分析数据集是通过去除不属于科级分类的纯化数据集分类单元而得到的。图1中提供了数据处理流程图。
图1 数据分析流程图。使用文本中描述的软件工具和程序将DNA序列处理成数据集，并在此处以流程图形式说明。有框的黑色文本表示为流程中重要的步骤或需要特别分析的数据集。灰色文本表示流程中使用的软件工具或过程。无框的黑色文本表示对特定数据集执行的分析。
6 SourceTracker
我们对纯化后的数据集，使用SourceTracker来评估对肺微生物群的贡献。分别评估每个受试者的支气管和肺组织微生物群，并仅提供受试者自己的口腔和鼻腔微生物群作为潜在来源。
7 多维排列
在完整数据集上，使用Bray-Curtis距离对对照和样本相似性进行β-多样性评估。PERMANOVA通过序列分批显示聚类，需要在进一步的PCoA或PERMANOVA测试之前对批效应进行统计调整。通过将线性模型应用于纯化的数据集，使用R软件（使用biom，base stats和vegan包）对序列批处理效应调整，从而产生β多样性数据集。还绘制了前10个OTU以表明它们对PCoA聚类的贡献。
8 排列测试
通过排列测试评估每个受试者的支气管和肺组织样品的相似性（与一个受试者的支气管样本和不同受试者的肺组织样本之间的相似性相比较）。观察值是Bray-Curtis距离矩阵中对角线值的平均距离（受试者支气管和肺组织相似性）。然后分别置换每个测序批次中的数据以说明批次效应。
9 中性理论分析
为了准备1797个OTU的完整数据集进行分析，我们首先去掉了在科级别未分类的223个OTU。得到的数据集有1574个OTU，分配给286个属。为了估计中性理论模型中的模型参数，我们使用了Sloan描述的矩量法。β分布的第一个形状参数是三个因素的乘积：平均肺部的总reads数，迁移概率，以及其中一个源位点（口腔，鼻腔和支气管）中每种微生物的平均相对丰度。类似地定义第二形状参数的定义，除了使用1减去源位置中每个微生物的平均相对丰度作为第三因子。我们将肺中的检测概率定义为微生物的相对丰度与检测极限的概率，检测极限是将肺中的平均总read数估计为1。由于肺中微生物的相对丰度遵循β分布，因此检测概率的理论值可以通过从检测极限到1的β分布的积分来计算。然后，通过最小化检测概率的理论值与在受试者中观察到微生物的频率之间的平方差的总和来估计迁移概率。检测概率预计值的置信界限是95％二项置信区间。所有分析均使用R版本3.3.2进行。
实验内容
1. 研究参与者的特征
表1中提供了九个研究对象的人口统计学和临床特征 。受试者年龄介于54至82岁之间，平均年龄为72.3岁。两名受试者是女性。按GOLD标准，3名受试者是轻度COPD，其余6名受试者是中度COPD。四名受试者在接受肺叶切除术时仍吸烟。受试者平均吸烟47.9包/年。三名受试者使用吸入皮质类固醇。
2. 从受试者样本中获得的序列多于对照样本
总体而言，来自9个受试者的36个样本在质量控制，过滤和OTU聚类步骤后产生12,667,009个序列（表2）。每个样本的平均和中位数序列分别为351,861和18,739，从较高生物量上呼吸道位点获得的序列明显多于低生物量的支气管和外周肺。六种试剂和实验室污染对照的样本经相同处理产生了75-820个序列（阴性对照样品的平均值和中位数分别为113和226）。对每个样本的低至563个序列进行二次采样，由于产量低，需要从分析中去除一个外周肺样品（对象8）。六个阴性对照样本中只有一个产生大于563个序列。
3. 上呼吸道样本的16S rRNA基因拷贝数多于下呼吸道样本
16S rRNA基因测序结果与在支气管和外周肺组织发现较少的16S rRNA定量PCR（qPCR）拷贝数一致。qPCR显示口腔群落含有大量16S rRNA基因拷贝（1.3×10 11拷贝/样本）比鼻腔菌群（3.3×10 9拷贝/样本），支气管菌群（1.2×10 7拷贝/样本）和外周肺组织（1.1×10 7份/样本）多。qPCR研究的方法和结果见图 2。
图2 支气管和肺组织微生物群包含的16S rRNA基因拷贝数是口腔和鼻腔微生物群的2 - 4倍。测定每个样品的16S rRNA基因qPCR的结果。16S rRNA基因拷贝数据按位点分组。支气管和肺组织微生物群16S rRNA基因拷贝数相似。广义估计方程表明总体p <0.001。使用Holm校正的配对t检验证明，除支气管-外周肺比较外，所有配对检验均显著。口腔与鼻腔相比较p = 0.004（**），其余比较p值<0.001（***）。
4. 鼻腔样本的α多样性低于口腔和肺样本
QIIME用于确定每个样品的α（样品内）多样性。Shannon多样性指数显示鼻腔样本的多样性不如口腔，支气管和肺组织样本，而口腔样本也不如肺组织样本多样化（图3a采用间歇效应校正的广义估计方程，P<0.001，采用霍尔姆校正完成post hoc配对t检验）。反辛普森多样性指数也表明，鼻样本的多样性低于外周肺样本(图3b采用间歇效应校正的广义估计方程，P<0.001，采用霍尔姆校正完成了post hoc配对t检验)。反Simpson指数在其他成对测试中没有显示出显著差异。这可能是因为与香农指数相比，辛普森指数对稀有物种不太敏感，稀有物种在支气管和外周肺样本中更为普遍。
图3 鼻部微生物群的多样性低于外周肺微生物群。采用Shannon指数(a)和反Simpson指数(b)评价各样本的α多样性。每个箱须图代表一个解剖部位（口腔、鼻、支气管或肺）。黑色水平条表示每个位点的中值，而方框表示第25和第75百分位值。胡须表示最极端（非异常值）数据点不超过四分位数范围的1.5倍。异常值用圆圈表示； 三个星号表示p <0.001，两个星号表示p = 0.01-0.001。每个位点的平均值±标准差在底部提供。Shannon指数数据（a）的分析表明各组之间的多样性不同（具有批效应协变量的广义估计方程，p <0.001）。使用Holm校正的post hoc比较表明，鼻部微生物群的差异远远小于所有其他位点。口腔菌群的多样性也明显低于外周肺组织菌群。反辛普森指数数据（b）的分析表明，不同群体之间的多样性并不相同（具有批效应协变量的广义估计方程，p <0.001）。使用Holm校正进行的post hoc比较表明，鼻腔微生物群的多样性不如周围肺部微生物群（p = 0.02）。
5. 口腔和鼻腔样本含有不同的微生物群;支气管和外周肺的微生物群是口腔和
鼻腔微生物群的混合
使用Greengenes 13_8版本完成序列的分类学分类。所有受试者的菌属分配均按部位汇总（图4）。在所有35个样本中，最常见的属（按降序排列）是链球菌，棒状杆菌，异球菌，普氏菌，韦荣球菌，罗思氏菌，奈瑟氏菌，和葡萄球菌。尽管在支气管和外周肺样本中观察到所有这些属，但大多数属主要在口腔或鼻腔样本中发现。口腔样本主要由链球菌组成，也含有普氏菌，韦荣球菌和罗氏菌-但很少含有棒状杆菌或异球菌的序列。后两个属在鼻腔样本中主要的代表菌属，其中含有少量的链球菌、普雷沃特氏菌、罗氏菌或韦氏菌的序列。
图4支气管和外周肺微生物分类群相似。使用Greengenes版本13_8确定所有序列的分类学。每个位点由一个条形图表示，颜色表示属级别的分类学分配，长度表示相对丰度。以<1％总相对丰度存在的分类群以白色表示。链球菌（蓝色）是最常见的属（占所有DNA序列的近19％），并且是口腔样本，支气管样本和外周肺样本中最常见的属（分别为38％，14％和14％） ）。相反，鼻腔样本含有1.6％链球菌序列。鼻样本以棒状杆菌为主（红色，42％的序列），其中5％为口腔序列。棒状杆菌分别占支气管和外周肺序列6.6％和9.4％。
链球菌 不仅是总体上最丰富的属，而且是口腔，支气管和外周肺微生物群中最丰富的属。通过受试者和部位检查属级水平的分类学指定表明每个受试者的支气管和肺组织微生物群彼此非常相似（图5）。
图5 受试者本身支气管和外周肺微生物分类群相似。使用Greengenes版本13_8确定所有序列的分类学分配。每个属的相对丰度由被试和解剖位点提供。每个条形代表一个单独的样本，颜色表示属级分类，长度表示相对丰度。白色代表类群，总相对丰度<1%。样本按受试者分组，口腔样本位于底部，然后是鼻腔样本，然后是支气管样本，周围肺样本位于顶部。颜色分配在图例中显示。每一个受试者的肺组织和支气管微生物都是相似的。
6. β多样性分析显示支气管和外周肺微生物群在受试者体内的相似性。
为了评价样本之间的相似性，使用Bray-Curtis相似性评估β-多样性。在对低测序产量样本进行均一化和剔除之前，我们首先评估了试剂和实验设备对照和受试者样本之间的相似性（图 6，表2）。六个阴性对照样本中的五个（浅棕色）在右上方形成了一个明显的簇。第6个阴性对照样本（对照2）与高生物量鼻腔样本簇（蓝色）相邻。阴性对照样本没有在低生物量支气管（红色）或外周肺（绿色）样本附近聚集。由于背景污染在低生物量样本（如支气管和肺）中比高生物量样本更为重要，因此我们得出结论，我们的低生物量支气管和外周肺样本不会受到试剂或实验室设备污染的严重影响。存在的唯一分类单元，并且在受试者样品中存在> 1％的相对丰度。由于乳酸菌是阴性对照样本中唯一存在的分类单元，且在受试者样本中相对丰度为> 1%，所以在稀化前将其从完整数据集中去除。
然后，我们在563个序列中对受试者样本进行稀释化。初步的PerMANOVA分析表明序列批效应，因此将线性模型应用于稀释的数据集以考虑批效应，从而得出β多样性数据集。对所有的用解剖部位标记的35个样本使用Bray-Curtis距离测量的PCoA显示按解剖部位聚类（图 7a）。口腔样本（红色）聚集在右上方，而鼻腔样本（紫色）则在左侧。支气管和周围肺样本（分别为绿色和黄色）聚集在图的右下方。正如所料，异球菌，葡萄球菌和棒状杆菌与鼻腔样本相关，而链球菌，放线菌和罗氏菌与支气管和周围肺样本相关。PerMANOVA显示通过解剖学来源聚类（p = 0.001，r 2 = 0.275;非均匀分散）。PCoA和PerMANOVA未显示受试者的聚类（图 7b，p = 0.44，r 2 = 0.238;均匀分散）。
图6 包括阴性对照的主坐标分析未显示低生物量肺源样本受到显著污染。对所有样本和阴性对照（提取和测序对照）进行Bray-Curtis距离的主坐标分析。阴性对照样本用棕色表示，口腔样本用紫色表示，鼻腔样本用蓝色，支气管样本用红色，肺组织样本用绿色。大多数阴性对照样本与临床样本分开聚类。一个阴性对照样本出现在高生物量鼻腔样本附近。低生物量样本（支气管和肺组织样品）不在阴性对照样本附近聚集。
图7 主坐标分析按解剖部位进行聚类使用QIIME和R在批效应校正后，采用Bray-Curtis距离的β-多样性的数据集进行PCoA。(a)口腔样本(红色)聚集在右上方，而鼻腔样本(紫色)聚集在左侧。支气管和周围肺样本聚集在图的右下角。异球菌、棒状杆菌和葡萄球菌与鼻样本相关，而放线菌属、链球菌和罗氏菌与支气管和周围肺样本相关。分析全部35个样本，观察到解剖部位聚类(PerMANOVA p = 0.001;r2 = 0.275;非均匀分散)。(b)样本按受试者用颜色编码(见图例)。当35个样本全部纳入分析时，未按受试者进行聚类(PerMANOVA p = 0.44;r2 = 0.238;均匀分散)。
当同一分析重新绘制以共同显示解剖部位和受试者时，支气管和外周肺微生物群之间的相似性甚至更清楚（图8）。解剖部位现在由符号形状表示，而受试者编号由颜色表示。包括相似颜色的线以表示每个受试者自身的支气管和外周肺微生物群之间的距离。每个受试者的外周肺微生物群都在他/她自己的支气管微生物群附近发现。受试者本身支气管和外周肺微生物群之间的距离小于受试者之间支气管和周围肺组织微生物群之间的距离（批量校正的置换试验，p= 0.0139）。这表明来自相同受试者的两个肺样品彼此更相似，而不是来自两个不同受试者的两个肺样品。
图8 所有受试者样本的主坐标分析均未显示按受试者聚类。使用QIIME和R对采用Bray-Curtis距离的β-多样性的数据集进行PCoA。样本按受试者进行颜色编码，样本位置由形状标记（参见图例）。来自相同受试者的支气管（圆圈）和外周肺样本（正方形）使用彩色的特定线条相连接。仅对17例支气管和周围肺部样本进行分析，支气管和外周肺部微生物群之间的受试者内部距离小于支气管和周围肺部微生物群的受试者间距离（批量校正的置换试验，p= 0.0139 ）。
7. 与鼻腔微生物群相比，肺部微生物群包含更多来自的口腔微生物群
为了确定上呼吸道（口腔和鼻腔）微生物群对下呼吸道（支气管和肺组织）微生物群的相对贡献，我们使用了SourceTracker。SourceTracker发现肺组织微生物群反映21.1%的来源口腔、8.7%的来源鼻腔和70.1%的未知来源。支气管微生物群反映出22.7%的来源口腔、5.5%的来源鼻腔和71.7%的未知来源（所有百分比是所有受试者的平均值，表3）。
8. 社区生态学的中性理论可以用上呼吸道微生物群描述外周肺微生物群
我们利用社区生态学的中性理论来识别独立源点（口腔，鼻腔或支气管）的OTU，这些部位可预测或不可预测相同的OTU存在于肺组织中。仅使用口腔微生物群作为来源地，许多口腔菌群（链球菌，普雷沃，小韦荣，罗氏菌，放线菌，奈瑟氏菌，梭杆菌，嗜血杆菌，和普氏菌）出现在肺组织菌群中，符合中性理论（图9a）。一个口腔分类群（卟啉单胞菌）和三个鼻腔相关的分类群（棒状杆菌，葡萄球菌和丙酸杆菌（丙酸杆菌属）的丰度似乎与社区生态学的中性理论不一致。口腔微生物群的迁移率为0.62，表明对于在肺中死亡的每种微生物，有62％的可能性将被口腔中的微生物替代，并且有38％的可能性将被替换为来自肺部的微生物。仅以鼻腔微生物群作为来源地，几个鼻腔分类群（棒杆菌属，葡萄球菌属，和奈瑟氏菌）出现在肺组织菌群中，符合中性理论（图9b）。一个已知的上呼吸道微生物群成员，并常常是COPD的病原体的莫拉氏菌与中性理论不一致，并且在肺组织微生物群中发现莫拉氏菌的频率低于在鼻腔微生物群中的丰度。大多数上呼吸道分类群位于口腔或鼻腔中，但不同时在这两个部位。不出意外，许多口腔相关类群（例如，韦荣球菌，梭杆菌，嗜血杆菌，放线菌，罗氏菌和普氏菌）的鼻腔丰度不能用中性理论预测肺组织存在情况。鼻腔微生物群的迁移率为0.74。
使用支气管微生物群作为肺组织微生物群的唯一来源，在我们的数据集中14个最常见的分类群中的11个与中性理论一致（图9c）。支气管微生物群的迁移率为0.69。与以支气管作为群落来源的中性理论不一致的分类群在我们的数据集中并不常见，在常见的肺病原体中也不常见。
图9 群落生态学的中性理论表明，支气管和肺组织微生物群密切相关。比较源微生物群与肺组织微生物群的中性模型。每个图包含一条实线，表示在给定的源丰度下肺中OTU的预期比例。虚线表示线的95％置信区间。位了清晰和易于展示，在X轴以对数刻度表示。在每个图的最左侧包括在肺部但未在源部位中发现的分类单元，并且截断的x轴分隔符用于指示尽管使用对数刻度，但仍显示这些数据点。（a）当口腔微生物群用作肺组织微生物群的来源群时，与普通口腔分类群（标记为1-15；例如，链球菌，普氏菌，韦氏菌，放线菌）对应的OTU遵循中性理论。许多在口腔部位（标记为A）未发现的OTU和低丰度口腔OTU（标记为B）在肺组织中比在中性理论中预测的更常见。一种常见的口腔OTU（卟啉单胞菌，标记为G）在肺组织中不如中性理论预测的那么常见。口腔分类群的迁移概率为0.62。（b）当鼻腔微生物群用作肺组织微生物群的来源群时，对应于常见鼻腔分类群（标记为1-5;例如，棒状杆菌，葡萄球菌，奈瑟菌）的OTU 遵循中性理论。未在鼻腔部位发现的OTU（标记为A）和低丰度鼻腔OTU（标记为B）在肺组织中比在中性理论中预测的更常见。值得注意的是，许多这些鼻腔低丰度的OUT有许多是常见的口腔分类群（例如，梭杆菌属，放线菌属，普氏菌属，韦氏菌属）。两种常见的鼻腔丰度OTU（标记为C和D，包括常见的COPD病原体莫拉氏菌）在肺组织中的常见程度低于中性理论中预测的水平。鼻腔分类群的迁移概率为0.74。（c）当支气管微生物群用作肺组织微生物群的来源群时，对应于常见支气管类群（标记为1-14，包括常见的口腔和鼻腔分类群，如链球菌，棒状杆菌，普雷沃氏菌和韦氏菌）的OUT遵循中性理论。几种低丰度支气管OTU（标记为A-F）在肺组织中比中性理论预测的更常见。与口腔和鼻腔来源的数据相反，只有一个OTU（标记为A，类杆菌）在支气管中未发现，但在肺组织中比在中性理论中预测的更常见。三个中度丰度的支气管OTU（标记为G-K）在肺组织中不如中性理论预测的那么常见。支气管微生物群迁移概率为0.69。
讨 论
这是第一项不通过口咽获取肺样本，确定轻度至中度COPD患者的肺组织微生物群的研究。我们的研究结果表明，在COPD肺部微生物群的先前研究中发现的口腔分类群是由于一种生理过程，如吸入，而不是在支气管镜检查或痰液中污染样品。我们的工作证实了Dickson等人的工作，该工作利用支气管肺泡灌洗来提供细菌主要通过微量吸入进入肺部的证据。COPD支气管和肺组织的微生物群是非常相似的并且由链球菌，棒状杆菌属，异球菌，普雷沃特氏菌、韦氏菌和罗氏菌组成。我们发现上呼吸道微生物群可能是肺组织微生物群的预测指标。我们的鼻腔和口腔样本中发现的分类群非常相似，但我们发现口腔和鼻腔之间很少重叠。支气管和肺组织样本反映了两个来源群落的混合。链球菌是一个大属，包含许多物种和血清型，适用于不同人类部位（即口咽，肺，皮肤）的定植或感染。因为16S rRNA基因高变区3序列的长度不足以区分链球菌属中的各种物种，我们的研究无法区分口腔链球菌和肺炎链球菌，一种常见的COPD肺病原体和肺炎的原因。此外，我们的研究发现相对较少的嗜血杆菌或莫拉氏菌在肺中，这两者通常与COPD中的恶化或气道定植有关。这可能是因为我们的研究对象表现出较轻的COPD表型，我们的受试者仅限于肺功能和合并症不妨碍肺叶切除术的受试者。
已有两项研究对肺移植时终末期COPD的肺组织微生物群进行了分析。这些研究确定了同一研究对象不同部位存在的不同微生物群。这些发现表明，由于COPD的进展和治疗，不同的肺部位（上叶，下叶等）以及肺部解剖学和生理学变化可能改变肺微生物群。出于临床原因，我们的研究仅限于评估每个受试者仅一个肺叶。因此，我们无法根据解剖部位评估肺部微生物群的潜在变化。在我们的肺部样本中链球菌和普雷沃特氏菌分别是第1和第4丰富的属，而我们的肺部样本中皮肤有机体/背景污染物较少见。棒状杆菌是一种常见的皮肤生物，是我们数据集中第二常见的分类群。然而，它优先在鼻腔样本中观察到，可能是由于皮肤和鼻子之间的距离接近。
我们对COPD肺组织微生物群的研究与之前使用BAL对COPD肺微生物群研究中发现的几种相同的细菌。在BAL研究中发现的分类群，但在我们最常见的分类群中没有发现的，仅有三个（普雷沃特氏菌，梭杆菌和嗜血杆菌）。值得注意的是，这三个分类群也在我们的研究中被确定，但相对丰度较低。本研究还鉴定了COPD肺微生物群中七种最丰富的分类群中的链球菌，棒状杆菌和罗氏菌。我们目前的肺部微生物群发现与我们自己和其他人使用BAL样本获得的先前结果相似。
我们使用SourceTracker进行的分析显示，受试者较低气道微生物群约30％反映了受试者上呼吸道样本的分类组成和相对丰度。其余70％的下呼吸道微生物群并未归因于使用该技术的上气道源。有几个因素可能结合在一起，表明大多数微生物群不是吸入的直接结果。一种可能的解释是在提取，扩增和测序过程中肺样本的污染。我们采取了几个步骤来尽量减少这个潜在问题。仅对样本进行扩增所需的最小数量的PCR循环以扩增产物，与样本一起试剂和环境对照均未扩增PCR产物。在进一步分析之前把最常见的对照分类群（乳杆菌）从数据集中删除。另一个导致“未知”肺微生物群的潜在因素是未取样的部位。未取样的上呼吸道生态位（即牙菌斑）或环境的一部分（即空气）可能对肺微生物群有贡献。第三种可能的解释是其中一个已知源站点的不完整采样。但因为口腔和鼻腔样品的稀疏曲线表明这些部位的彻底取样（数据未显示），提示这不太可能。四种可能性是在所有位点存在动态微生物群，使得在给定时间点的肺微生物群不仅仅同时反映源群落的含量和相对丰度，有可能发生“生态漂移”，允许一些分类群在肺部生长，而其他分类群则被免疫系统或粘膜纤毛间隙选择性地去除。
群落生态学的中性理论试图根据已知的相关源群落的组成来预测群落的组成。在这个理论中，与新环境相比，群落组成不受任何生物体对源环境的固有生物适应性的影响。因此，可以基于源群落组成来预测遵循中性理论的OTU。不遵循中性理论的OTU可能潜在地指示该生物在新目标环境中的生态漂移。我们的群落生态学中性理论将口腔和鼻腔微生物群确定为肺组织微生物群的重要来源，分别有62％或74％的可能性，即在肺组织中死亡的OTU将被其中一种生物体取代。反过来，生理漂移发生的可能性为38％或26％（用肺组织OTU替换死亡的OTU），而不是分别用口腔或鼻腔OTU替代。鉴于支气管和肺组织之间的接近解剖接近，因此，中性理论同样适用于支气管和肺组织微生物群之间的联系也就不足为奇了，死亡的肺组织OTU被来自支气管的OTU替代的概率为69%。我们注意到，由于样本量较小，用于计算迁移概率的统计技术无法可靠地计算置信区间，因此我们无法得出哪些来源对肺微生物群的影响最大。
Venkataraman等发表了一项关于健康肺微生物群与囊性纤维化（CF）和特发性间质性肺炎（IIP）肺微生物群的研究。他们应用中性群落模型，发现健康的肺部微生物群与口腔吸入一致，在健康肺部很少或没有选择分类群（适应岛模型）。相比之下，CF和IIP肺部微生物群选择了特定的分类群。Dickson等人使用BAL比较健康受试者的上呼吸道和肺微生物群，并确定当从更近端的肺部位置获得肺样本时，上呼吸道和肺微生物群之间的相似性增加。这项研究也支持了自适应的岛屿模型。Bassis等人在使用BAL样本对健康肺的研究中得出结论，健康肺能够选择性地清除从口咽部吸入的普雷沃特氏菌。我们的研究表明，可以选择性地从早期COPD肺组织微生物群中清除卟啉单胞菌或莫拉克菌。慢性阻塞性肺疾病越严重或加重越频繁的肺可能表现出更多的生态漂变。
我们使用SourceTracker的研究表明，肺组织微生物群表现出显著的生态漂移，超出了使用中性理论的范围。这两种分析都是对相似但又截然不同的现象进行建模：SourceTracker在一个时间点模拟微生物群的组成，而中性理论模拟“死亡”微生物群随时间的替代。总之，两种不同的分析表明，虽然肺微生物群经常被鼻腔和口腔类群取代，但随着时间的推移，肺微生物群的组成与上呼吸道来源的相似性越来越少。模型之间的另一个重要区别是SourceTracker同时考虑多个源，而中性理论一次只考虑一个源。SourceTracker似乎对在肺和支气管中发现的许多低丰度分类群更敏感。
尽管我们的研究存在局限性（样本量小，缺乏非COPD对照受试者，以及无法区分口腔链球菌和肺炎链球菌），我们已经证明，COPD患者的肺中存在口腔分类群是由于一种生理过程，如吸入性，而不是由于采集时的样本污染。我们在轻度和中度慢性阻塞性肺病中的发现可能不能代表健康的肺微生物群或严重或非常严重COPD的肺微生物群。
结 论
使用避免肺部样本口腔污染的技术，我们发现轻度或中度COPD肺组织微生物群包含上呼吸道分类群。我们的研究非常重要，因为它是第一项证明COPD肺中发现的口腔细菌由于生理过程（如吸入）而不是实验过程中上气道污染而存在的研究。本文报道的肺取样技术可能在未来的研究中用于验证研究COPD肺组织微生物群的非侵入性替代样本。
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