编译：流年梦，编辑：小菌菌、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
导读
宿主与其相应微生物群落之间的相互作用现在被认为是生态、进化和发展的基础。这些相互关系激发了多细胞生物作为“宏生物”的新观点。但是对于微生物群落为什么以及如何与从海绵到人类再到植物等不同分类群宿主形成长期的联系尚不清晰。
该研究利用和比较了不同的测序方法（如在扩增子测序中采用不同的扩增方式，不同的扩增区域；鸟枪测序），揭示不同类型宿主的微生物特征。
该研究结果证明，虽然基于16S rRNA扩增子测序备受争议，但是该研究通过模拟的微生物群落证明在反映细菌微生物群落特征的许多方面与实际情况是一致的。同时多种方法的比较证明一步扩增要比两步扩增效果好，选择V3-V4区进行扩增子测序要比V1-V2区好，为今后针对不同的宿主样本的方法选择提供参考。通过比较物种分类和菌群功能特征与宿主系统发育的关系，发现了广泛的进化模式：宿主由水生到陆生的转变导致与宿主相关微生物组成的进化。
原名：Comparative analysis of amplicon and metagenomic sequencing methods reveals key features in the evolution of animal metaorganisms
译名：扩增子和宏基因组测序方法的比较分析揭示动物metaorganisms进化的关键特征
期刊：Microbiome
IF：10.575
发表时间：2019.9
通讯作者：Philipp Rausch
样本选择：
①水生后生生物，包括海水系统[Aplysina aerophoba (海绵)和Mnemiopsis leidyi (水母)]、
② 淡水系统[Aurelia aurita, Nematostella vectensis, Hydra vulgaris]；标准脊椎生物[Mus musculus(小白鼠)]；
③ 无脊椎生物[Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans]；
④ 人类[Homo sapiens]；
⑤ 小麦[Triticum aestivum(普通小麦)]；
⑥ 模拟系统[8种细菌，2种酵母]，每个类型样本均有五个重复。
每个样本分别进行两种方法的测序：扩增子测序（V1-V2；V3-V4）、宏基因组测序。同时，扩增子测序中同时使用一步扩增程序和两步扩增程序进行测序。探究不同测序方法对微生物分类和功能研究结果的影响；进一步探究宿主进化与微生物组成及功能的关系。
1. 扩增子测序数据处理和质量控制
所有的扩增子测序数据均采用统一的数据处理和质量控制方式（测序方式可分为四种：结果显示一步扩增的V1-V2测序的reads保存量最多（62.13±23.90%），其次是两步法的V1-V2测序结果（49.85±23.90%）。V3-V4测序数据中，两步法扩增比一步法的reads保存量要多（42.02±16.41% VS 36.88±23.89%）。在嵌合体含量上,一步法V3-V4区含量最低，总体来看V1-V2区测序数据的保存量要比V3-V4区测序数据的要多，一步法扩增的V1-V2测序获得的数据量最多，两步法扩增的V3-V4测序获得的数据最少，平均每个样本获得0.46Gb的数据（分布在0.03-2.1Gb）。
2. 虚拟微生物群落
该研究通过模拟的微生物群落研究了不同方法的准确性。结果显示，V1-V2区不能区分Escherichia和Shigella，鸟枪测序同样也出现物种分类错误的问题（图1a）。一步法扩增的V3-V4区测序所呈现出的误差最小。另外，鸟枪测序对真菌的群落的测序结果与实际较为相似（图1b）。进一步，比较了α和β多样性在不同方法之间的差异。令人意外地是所有的方法均高估了分类的丰富度但是低估了菌群的复杂性（图1c，图S4，表S2）。总体来说，扩增子测序更准确地反应了α多样性（虽然与实际值也存在显著的差异）。对于β多样性而言，鸟枪测序所得到的数据与实际菌群距离最远，V3-V4扩增子测序最近且不同的扩增子测序技术之间没有显著的差异（图1d）。因此，在该研究中，鸟枪测序相对于扩增子测序而言存在更大的误差。
图1 a 不同测序方法中细菌微生物的组成特征；b 鸟枪测序中真菌微生物的组成特征；c 比较不同测序方法与实际的α多样性；d 通过基于Bray-Curtis距离的PCA分析揭示不同测序方法之间的反应微生物菌群β多样性上的差异。
3. 宿主种内和种间的物种分类多样性
进一步该研究使用上述测序方法研究复杂的宿主微生物群体。不同方法在反应微生物群落α多样性上基本上是一致的（图2a，b）。另外，该研究发现水生生物样本中的α多样性要比陆生宿主的高（图2c，d）。为了探究不同测序方法和宿主的细菌群落组成上的相似性，进行了β多样性的分析。结果显示微生物群落在宿主之间存在较大的差异（无论选择哪种方法）（图3）；宿主之间的两两比对结果同样显示宿主之间存在显著性差异，除了两步扩增的V3-V4区测序结果（表S6）。另外，该研究发现水生和陆生生物宿主的微生物群落存在明显的差异（图3b，d），与分析α多样性的结果一样。在宿主种内的微生物群落存在变异性，其中C. elegans、A. aurita、H. sapiens、H. vulgaris、T. aestivum、M. leidyi要比其他的宿主变异程度高（图S17A和C）。有趣的是，种内的差异距离在水生生物和陆生生物之间同样存在显著的差异，陆生生物大于水生生物（图S17B和D）。该研究判定了引起不同宿主的β多样性差异的标记物种（属水平）。根据扩增子测序结果，引起差异的物种有56个（四种测序方法判定结果的交集）。同时还发现了引起不同环境之间β多样性差异的标记物种（表S9和10）。使用鸟枪测序技术判定的标记物种要比通过使用扩增子测序结果分析的要少，但是大部分是一致的。
图2 a比较不同测序方法在反映属水平丰富度上的差异；b比较不同测序方法在反映香浓指数上的差异；c 比较水生生物和陆生生物的微生物α多样性（基于属水平丰富度）；d 比较水生生物和陆生生物的微生物α多样性（基于香浓指数）
图3 a基于Bray-Curtis距离的NMDS分析比较不同宿主之间的微生物组成差异；b 基于Bray-Curtis距离的NMDS分析比较水生和陆生生物的微生物组成差异；c 基于Jaccard距离的NMDS分析比较不同宿主之间的微生物组成差异；d 基于Jaccard距离的NMDS分析比较水生和陆生生物的微生物组成差。
4. 宿主种内和种间的功能分类多样性
该研究通过NOG和CAZy数据库注释鸟枪测序结果来解释功能多样性。结果显示宿主之间存在显著性的差异（P < 0.05）,但是不同注释方法之间存在差异。脊椎动物表现出最大的功能多样性，水生生物中只有H. vulgaris和A. aerophoba表现出较大的功能多样性（图4a）。有趣的是，与物种多样性不同，在水生和陆生生物之间未发现功能多样性上的差异（图4b）。
图4 功能多样性（基于NOG数据库注释）。a 不同宿主中基因的丰富度；b 水生生物和陆生生物的微生物在功能多样性上的差异；c基于Bray-Curtis距离的NMDS分析比较不同宿主之间的微生物组功能上的差异；b 基于Bray-Curtis距离的NMDS分析比较水生和陆生生物的微生物组功能差异
5. 差异标记的功能
该研究鉴定了引起宿主间功能差异的标记功能。结果显示，基于NOG注释结果，CRISPR相关基因导致了A. aerophoba, H. sapiens和H. vulgaris功能的差异，表明这些群落中存在非常重要的病毒。另外多数物种的功能标记多集中在能量产生和保存、氨基酸转运和代谢、复制、重组和修复上。基于CAZy数据库注释结果，H. sapiens和M. musculus存在较多的糖苷水解酶，A. aerophoba和H.sapiens存在较多的多糖裂解酶，A. aerophoba与纤维素酶有关，H. vulgaris携带木质素和几丁质降解基因。这些特征可能在一定程度上反映了宿主的饮食相关。
6. 结合PICRUSt和16S rRNA扩增子测序预测菌群功能
该研究比较了基于PICRUSt预测的功能和鸟枪测序得到的功能之间的差异。通过分析模拟的微生物群落，V1-V2区测序数据的NSTI（Nearest Sequenced Taxon Index）要比V3-V4区测序的高，表明V1-V2区测序数据预测结果要比V3-V4区测序的预测结果要差。进一步与鸟枪测序数据COG注释结果进行比较，发现有很大的重叠部分，其中categories R和S除外。在不同的测序方法之间未发现存在显著的差异（平均NSTI值<0.15）,但是大概31.8%的样本存在丢失（NSTI>0.15）（图5a）。对于不同的宿主，A. aerophoba和H. vulgaris所有的预测结果均在阈值以下，其他宿主中不同扩增区域实验组之间存在不同的预测效果，如H. sapiens。N. vectensis和T. aestivum使用V3-V4区预测的结果要比V1-V2的要好。但是与鸟枪测序结果比较时，与V1-V2区预测结果的一致性要比V3-V4区好（图5b）。通过PCA分析不同方法之间在高水平功能分类上的相似度，结果显示不同的测序方法之间差异较小，但是与鸟枪测序结果差异较大（图5c）。在鸟枪测序数据的不同处理方式之间依然存在差异，但是这种差异要比与预测结果的差异要小（图5c）。因此，该研究证明基于PICRUSt预测的功能数据与实际的鸟枪测序结果存在显著的差异。
图5 a不同扩增子测序方法的NSTI差异；b 不同扩增子测序方法对应的PICRUSt功能预测结果与鸟枪测序结果的Procrustes相关性；c 基于Bray-Curtis距离的NMDS分析比较不同扩增子方法对应的PICRUSt功能预测结果与鸟枪测序结果（不同的注释方法）的差异。
7. 微生物群落组成的进化模式
该研究评估了宿主间的进化距离与微生物群落β多样性之间的关系（采用Procrustes分析）。结果显示，当群落在目或科水平上进行分析时，与宿主的相关性最大，其中一步法V3-V4区测序结果相关性最强（图6），鸟枪测序结果与扩增子测序结果相似。另外，该研究发现基于丰度的β多样性计算方法（图6b，Bray-Curtis）与宿主之间的相关性要比基于细菌菌群在宿主间共现（图6a，Jaccard）的计算方式要强。为了分析对单个宿主的适用性，该研究探究了宿主进化距离和群落组成相关性的残差，结果显示宿主之间存在较大的差异性，M. musculus、M. leidyi、H. sapiens、和D. melanogaster最大，H. vulgaris、C. elegans和A. aerophoba最小。进一步，该研究鉴定了哪些物种与宿主的进化距离相关性最大（Moran`s I eigenvector method）。根据多种扩增子测序方法，共获得41个科和36个目与宿主进化距离相关性最大，其中16个科和18个目在是所有扩增子测序数据中共存的。基于鸟枪测序结果，共获得72个科和19个目与宿主进化距离有关，其中有17个目和20个目是与扩增子测序结果重复的。
图6 a 宿主间的进化距离与微生物群落β多样性（基于Bray-Curtis距离）之间的相关性；b 宿主间的进化距离与微生物群落β多样性（基于Jaccard距离）之间的相关性。P-S代表具有不同的分类水平的计算结果，Function WGS代表宿主间的进化距离与微生物群落功能β多样性之间的相关性，不同的形状代表不同的注释方式。
8. 微生物群落功能组成的进化模式
为了将分类学上观察到的模式与基于功能的模式进行对比，该研究评估了宿主间的进化距离与微生物群落距离（基于功能类别进行计算）的关系（采用Procrustes分析）。CAZy和单个EggNOG方法进行的计算结果与宿主进化距离相关性最强（图6）。与基于微生物群落组成的进化模式相似，宿主进化距离和群落组成相关性在不同个体之间存在差异性（图S28），T. aestivum和D. melanogaster表现出最低的相关性，C. elegans, M. musculus和H. sapiens表现出最大的相关性。从环境分类上看，陆生宿主比水生寄主的相关性略好。
进一步，该研究鉴定了哪些功能与宿主的进化距离相关性最大（Moran`s I eigenvector method）。结果显示，大多数基因均与特定的宿主或与1-3个宿主相关（脊柱动物）。例如CAZy数据库注释结果中的岩藻糖转移酶、岩藻糖苷酶和多糖结合蛋白，以及透明质酸、黄原胶和软骨素的裂解酶（表S17），这些功能与多糖和粘蛋白的降解有关，或许介导了宿主与微生物之间的相互作用。相似的结果也在NOG数据库注释结果中出现。同时还有其他的功能与脊椎动物相关，反应了这类宿主微生物的功能多样性。只有LPCX和LPXK（与外膜的合成有关）基于与非脊椎动物存在相关性（表S19，图S28）。
扩增子测序由于依靠PCR扩增导致存在一定的技术弊端，该研究通过模拟的微生物群落比较了一步扩增和两步扩增以及不同测序区域对测序结果的影响：
① 结果指出一步扩增的V3-V4区测序方法在该研究中最为准确地反应微生物物种组成、α多样性和β多样性，且同时发现即便是不基于PCR扩增的鸟枪测序在反映微生物群落特征上并不比扩增子测序准确。
② 该研究通过比较鸟枪测序和基于扩增子测序的功能预测，结果证明今后使用功能预测时需要谨慎考虑。
③ 该研究通过比较不同进化水平的样本（从水生到陆生）发现陆生生物具有较高的微生物α和β多样性，但是在功能上不存在显著差异。
④ 同时该研究发现宿主间进化距离与相应微生物群落β多样性之间存在较强的相关性，说明了宿主的进化导致了相关微生物组的变化。
你可能还喜欢
综述 | Cell：炎症性肠病的治疗机遇：宿主 - 微生物关系的机制解析
重大综述 | Nature Reviews Microbiology：土壤微生物组和气候变化的全方位阐释
这些或许也适合你哦👇
最低只需1000元！微生太宏基因组测序分析大促销！
培训 |（直播培训课）20小时快速通关R语言个性化制图
