科研 | PNAS：干旱延缓了高粱根际微生物组群的发育并富集了单相细菌
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干旱胁迫是作物生产力的主要障碍,干旱的严重程度和频率将在下个世纪增加。某些与根相关的细菌已经被证明可以减轻干旱胁迫对植物生长的负面影响，并且作物微生物组群的操纵是克服农业系统对干旱胁迫的新兴策略，但干旱对根际微生物组发育的影响很难理解。通过16S rRNA扩增子和宏转录组测序，以及根系代谢组学，我们证明干旱延迟了早期高粱根际微生物组群的发展，并导致单相细菌的丰度和活性增加，单相细菌缺乏外细胞膜并含有厚的细胞壁。我们的数据表明，植物代谢的改变和细菌（ABC）转运蛋白基因活性的增加与群落组成的这些变化相关。最后，使用单相细菌的接种实验表明，在干旱期间根的增殖定殖可以对植物生长产生积极影响。总的来说，这些结果证明了干旱在重组根际微生物组群中的作用，并突出了研究植物相关微生物组群时的时间采样的重要性。
论文ID
原名：Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria
译名：干旱延缓了高粱根系微生物组群的发育并富集了单相细菌
期刊：PNAS
IF：9.504
发表时间：2018年
通信作者：Devin Coleman-Derr
通信作者单位：Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley
实验设计
实验设计图
实验内容
1. 干旱胁迫延缓了高粱微生物组群的发育
在植物发育初始期间（TP0-TP2），当所有三种处理相同时，根际和根样品中的微生物多样性在幼苗出苗后呈现快速增加（TP1-TP2），随后在1周后同样快速但较小的减少（TP3）（图1A-C）。 这与观察到的对于经历内源异养演替的微生物群落系统发育多样性的变化一致，多样性在群落发育的中点达到峰值。 在最初的定殖期后，干旱和对照处理的比较表明，相对于对照，预先开花和后花后干旱处理均导致根内（~20％）和根际（~15％）的香农多样性水平显着降低。 （图1B和C）; 相比之下，香农在土壤中的多样性水平基本保持不变（图1A）。
用预先开花的干旱和对照样品进行的这些分析表明，属于根，根际和土壤的样品聚集在不同的组中（图1D）。另外，样品显示根据它们在每周水（图1D，绿色阴影）或干旱（图1D，橙色和红色阴影）处理下的时间长度分离。对于所有对照和预先开花的干旱样品，使用Bray Curtis算法进行置换多变量方差分析分析。这些分析表明，细菌群落受样本类型，时间点和治疗的影响最大。对每种样本类型单独进行的PCoAs显示，根（图1E）和根际群落表现出比土壤群落更大和更有活力的成分变化，如通过PCoA图中前两个轴解释的时间点和更大的组合变化之间的更大分离表明（根= 65.4％，根际= 54.2％）与土壤样本（土壤= 29.5％）相比。根和根际样品的“拱形”形状是微生物环境的特征，其中沿环境或时间梯度具有高度转换，并且表明植物微生物组在发育期间表现出强烈的生态位分化并且可能 受到生物化学的巨大变化。
相对于对照样品，根和根际群落在干旱处理下表现出细菌群落发育的停滞进展（图1E），如在每个时间点干旱和对照样品的不同相对位置所示（由独特颜色表示）。然而，尽管微生物群落发育的时间存在这些差异，但两组样本都遵循共同的轨迹。这种延迟在所有时间点干旱和对照处理的根样本之间，相对相异性的热图中也很明显（图1G），这表明在整个预先开花的干旱处理（TP3-TP8）中，干旱胁迫的植物根的概况最接近于来自TP3的较年轻对照植物的根微生物组（图1G，红色矩形）。根系微生物组的延迟转变可能通过干旱诱导的植物发育减缓来解释，因为我们观察到预先开花的干旱也导致后期开花时间和植物生长速率降低。然而，在对照重复中（图1F）和在预处理的重复中的类似比较（图1H）之间的时间点之间的群落差异的并排比较揭示了收集的根之间的更大区别在干旱胁迫的植物中浇水之前和之后，在对照处理中开花前后收集的根之间，表明干旱对根微生物组的影响超过了植物发育所施加的效果。
图1：干旱影响根微生物群的发育。在每个时间点在预先开花的干旱（橙色系），后期开花干旱（黄色系）和对照（蓝色系）处理下的平均香农指数在土壤（A），根际（B）和根（C）的多样性。每条线上方和下方的阴影区域表示与平均值的标准偏差。由垂直虚线划分的橙色和黄色阴影区域分别表示施加预先干旱和后花期干旱的时期。（D）Bray Curtis的PCoA距离用于所有对照和预先干旱样本。标明了土壤（▲），根际（■）和根样品（●）。每种形状的颜色表示施用浇水的周数（绿色阴影）或干旱处理（橙色和红色的阴影）。（E）Bray Curtis的PCoA对于按时间点着色的所有对照和预先开花的干旱根样品的距离。各个时间点（TP1-TP17）由不同颜色表示，初始时间点（TP1-TP2）显示为深灰色（仅限对照图），早期时间点（TP3-TP8）显示为绿色阴影，晚期时间点（TP9-TP17）显示为蓝色和紫色。（F-H）在指定的处理对和时间点内的所有根样本重复之间的平均对Bray Curtis距离的热图。显示了对照样品与对照样品（F）的比较，预开花干旱与对照样品的比较（G），以及预开花干旱与预开花干旱样品（H）的比较。 绿色和粉红色的阴影分别代表低和高的Bray Curtis距离。橙色和绿色线分别表示干旱和对照处理的平均开花时间，而黑线表示干旱处理结束时的重复浇水事件。（G，左下）红色矩形突出了TP3-TP8的干旱处理样品与属于TP3的对照处理样品之间的强烈相似性。
2. 以优势类群动态移位为特征的早期根际内源群落
门水平相对丰度图显示，根和根际群落表现出动态移位的初始阶段（TP1-TP6），随后是相对稳定性（图2C和E）;在周围的土壤群落中没有观察到类似的早期变化（图2A），这表明这不仅仅是周围微生物组的变化的结果。根和根际微生物组在实验后期的相邻时间点和周围土壤的微生物群落之间表现出相对大的组成差异。根微生物组的早期组成波动性是由大量优势门的相对丰度的显着变化驱动的，包括放线菌，厚壁菌和变形菌（图2E）;相比之下，发育后期（TP7-TP17）中最显着的门数水平变化是在较不丰富的谱系中。虽然上述结果表明根微生物组的后期发育相对稳定，但当使用更精细的分类学时，一些微生物谱系可观察到高粱根和根际微生物组在整个植物发育过程中的时间重组的证据，正如整个实验中持续的变形菌（Proteobacteria）和放线菌（Actinobacteria）的家族水平变化所证明的那样。
干旱诱导早期根际微生物群落中单相细菌的富集。这种富集在干旱处理（6周）的过程中进行，直到重新开始浇水（图2）。引人注目的是，在重新开始浇水后1周内，先前经过处理的植物的根微生物组迅速恢复到在较年轻的对照根中观察到的群落进展模式（图1E和G和2）。这种快速复水引起的的转变是由于变形菌和拟杆菌的相对丰度增加了200％以上（P <0.001），并且放线菌的丰度大幅减少（P = 0.012） （图2）。
如前所述，后期开花干旱和对照处理群落的比较显示，与预先干旱的一样，多样性在根和根际干旱下降低，但在周围土壤中则没有（图1A-C）。然而，对门水平相对丰度的探索表明，后期开花期间整体根关联的细菌群落组成相对稳定且与对照相似。开花后和对照处理后的样品中的PCoA表明相对缺乏聚类。尤其是根和根际样品，与以前的预先干旱和对照样品分析相比较。最后，对干旱和对照处理根系之间的平均差异进行的分析表明，在干旱处理的第一周后，与对照相比，预先开花的干旱处理与之后每个时间点的后期干旱处理相比具有更大的差异。这些结果表明，在植物发育晚期发生的干旱伴随着与早期植物发育中观察到的类似的微生物多样性的减少，其对根微生物群落组成的影响显着较小。
图2：细菌门的相对丰度。对照（A，C和E）以及土壤（A和B）,根际（C和D）和根（E）的对照（A，C和E）和干旱（B，D和F）处理的前13个最丰富门的百分比相对丰度百分比（E和F）。所有时间点（TP1-TP17）沿x轴顺序排列。
3. 干旱处理的根际中的放线杆菌转录物表达增加
根据我们的扩增子分析结果，在对所有转录物的全局分析中，我们观察到根际干旱期间放线菌转录物表达的显着增加（图4A），这反映了他们观察到的16S rRNA数据相对丰度分析的增加（图2C和D）。这些结果表明，放线菌不可能增加放线菌的丰度，这将导致大部分休眠细胞的转录活性降低。与根际相反，土壤中的类似分析显示放线菌转录物没有增加，但确实看到属于厚壁菌的转录物的表达增加（图4A）。我们使用九个核心基因（gyrA，recA，rpoB，rpoA，gyrB，gap，rho，ftsZ和secA）进行了分类学分析。在根际土壤中，相对丰度谱显示出大致相似的模式，包括干旱处理下的放线菌的核心基因转录物的大量富集，其在复水时减少。然而，这一分析确实揭示了与全局分析相比的一些差异;例如，先前观察到的干旱处理土壤中的厚壁菌转录物的增加，在核心基因分析中没有再现。我们预计这种差异可能是厚壁菌的九个核心基因相对缺乏。总之，这些结果表明，虽然根际和土壤相关的微生物群落在分类学特征方面可能对干旱胁迫的反应相似，但它们在表现出差异表达的基因的数量和类型方面的反应不同。该结果类似于先前在16S rRNA数据集中差异丰度的比较中观察到的结果，其中干旱处理的根和土壤产生类似的OTU富集和消耗的模式，但是这些变化的数量和大小方面存在差异。
图3：所有干旱富集和耗尽的根属的系统发育树。图中心的系统发育树是由来自所有属的一个代表性OTU序列构建的，所述代表在根样品中含有预先开花的干旱富集或耗尽的OTU。 内部彩色环代表每个属所属的门（如图2中的图例）。 中间环表示每个属的通常认为是单细胞菌门，通常被认为是dider（浅蓝色）的门，或者是单细胞菌门或混合（深蓝色）的门。 与对照根相比，有色条的外环代表干旱处理的根中每个属的相对log2倍富集（红色）或耗尽（蓝色）。
4. 干旱增加与代谢物运输相关的放线杆菌转录物表达
在根际，我们观察到与碳水化合物转运和代谢，氨基酸转运和代谢以及次级代谢物生物合成相关的转录物中干旱峰值（TP8）显着增加（图4B）;相比之下，土壤在所有这三个类别中表现出相对减少，并且富集了一系列独特的功能，包括能量产生，转录和翻译后修饰（图4B）。根据我们对宏转录组数据分析，这些数据还显示，所有功能类别中根际的大部分干旱富集基因（~90％）属于放线菌（图4C），而土壤群落约为50％（图4C）。最后，为了确定碳水化合物和氨基酸转运和代谢基因（GO）类别的富集是否仅仅是放线菌的相对丰度增加或者放线菌功能的转变的结果，我们对所有放线菌转录物的GO功能类别分配进行了分析。该分析表明干旱诱导的根际功能的变化是由几乎所有GO功能类别的放线菌谱系中基因表达的显着变化驱动的，碳水化合物和氨基酸转运和代谢，以及ABC转运蛋白的增加表达。总之，这些数据表明干旱对根相关微生物组的转录活性有显着影响，与碳水化合物和氨基酸代谢和转运相关的根际基因在干旱下表现出增加的表达，并且根际转录活性改变。
图4：干旱影响根微生物组转录。（A）在宏转率录数据中所有转录物的前13个门的百分比相对丰度，对于TP8和TP9的所有对照和干旱处理的样品，可以从根际（左）和土壤（右）分配分类。（B）对于在TP8下根际土壤（左）和土壤（右）的干旱下显示富集的所有基因的GO富集分析。x轴上的值表示每个类别中在干旱下上调的基因的相对百分比的倍数相对于整个数据集内相应类别中基因的总相对百分比。省略了少于5个差异表达基因的类别。这红色圆圈表示在实验中富集具有<0.05的P值的类别（*P≤0.05; **P≤0.01; ***P≤0.001）。（C）可分配分类的所有转录本的前13个门的相对丰度，并显示根据GO类别（y轴）分离的TP8和TP9根际土壤（左）和土壤（右）处理的差异表达。省略了少于5个差异表达基因的类别。每个门使用的颜色图例如图2所示。
5. 在干旱下根系中富含放线菌
我们观察到，与对照相比，两种标记菌株在干旱后显示出大约两倍高的定殖水平，如荧光密度增加所示（图5）。同样，用PEG 6000处理植物，这是渗透胁迫的另一个原因。用于模拟对照实验中的干旱，与对照相比，也显示出明显增加的定植。这些结果表明，在没有来自其他微生物的竞争下，个体放线菌可以在干旱下具有绝对富集，表明单独的生态位扩展不太可能完全解释观察到的现象。出乎意料的是，两种菌株在接种后也诱导了适度但显着的根生长增加，并且这种生长促进仅在暴露于干旱处理后才能观察到。总之，这些数据表明，在受控制的实验室环境中以及在没有其他微生物的情况下，观察到的干旱期间放线菌丰度的增加伴随着定植的增加，并且这种增加可能有益于植物健康。
图5：链霉菌在干旱下表现出高粱根的定殖增加。共焦荧光（A1和A3）和亮视野（A2和A4）成像标记的链霉菌属菌株Sc1在基因型RTx430的对照（上部）和干旱处理的（下部）根上的定殖。（比例尺：50μm。）测量荧光强度的小提琴图使用共聚焦荧光显微镜检查24个对照（绿色）和24个干旱处理（橙色）根样品。AU，任意单位。
讨论
特定植物代谢物的渗出可以影响根微生物组成，并且渗出曲线的正常发育驱动的变化与植物相关微生物组的变化相关。在干旱下与细胞壁结构相关的单相细菌富集的一个可能原因是植物宿主过量产生G3P（图6）。在我们的接种实验中观察到短期干旱后观察到的放线菌的绝对富集，其中根仅暴露于单一微生物菌株。虽然干旱引起的大多数其他氨基酸和糖的产量增加并未提供对放线菌谱系特异性增加的明确解释，但G3P是肽聚糖生物合成的重要前体，肽聚糖生物合成是细菌细胞壁的主要成分。鉴于肽聚糖层的平均厚度增加，已经表明G3P可以作为生长速率的正调节剂。我们注意到，在根际微生物组中与G3P相关的ABC转运蛋白和代谢途径中，干旱期间活性增加，其中大部分（98％）特别属于放线菌。基于这些结果，可以想象，植物根部内G3P的过量产生可能导致该代谢物渗入根际和质外体，其中被放线菌用于促进其生长。
图6：在根相关微生物组中干旱期间选择单细胞门的模型。（1）早期植物根系发育选择正常灌溉。（2）干旱引起植物根系代谢的变化，包括一系列碳水化合物，次级代谢产物和氨基酸的增加。这些变化导致这些和可能的其他代谢物的渗出，这反过来又支持特定的生长。此外，通过未知的机制会导致所有细菌的绝对丰度降低，但对于具有单细胞壁的单相细菌具有更大的选择。（3）复水导致代谢物介导和其他未知压力的释放，允许单相细菌的快速生长并恢复在对照条件下观察到的根微生物组发育和活动的模式。
评 论
干旱仍然是下个世纪粮食需求的关键障碍。了解干旱胁迫，植物发育和植物微生物组之间的相互作用是应对这一挑战的关键。证明干旱导致根系中一组独特的微生物富集，几乎完全由单细胞组成，缺乏外膜并且具有厚的细胞壁。证明在干旱下，根增加了许多代谢物的产生，并且单相细菌栖息于干旱处理的根际表现出与这些相同化合物中的一些相关的转运蛋白活性增加。这种干旱诱导的富集的发现以及植物和微生物之间代谢物交换的相关变化揭示了操纵植物微生物组以改善作物适应性的潜在应用蓝图。
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