科研 丨SBB: 土壤原核生物群落适应力，真菌定殖和增加跨域共现响应植物生长促进有机修正
编译：茗溪，编辑：小菌菌、江舜尧。
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在以有机肥料为基础的农业系统中，原核生物和真菌的活性对于复杂底物的降解和植物吸收营养物质的释放至关重要。因此，了解这些系统中微生物群落的动态，有利于制定优化养分利用率和提高植物生产力的成功管理策略。其中，有机基质提供的微生物接种物如何在土壤中持续存在并与土壤和植物微生物群系相互作用引起了学者极大的研究兴趣，因为这些过程可能影响有机改性剂的长期效益。
为了观察经过富含养分和复杂有机质的土壤改进剂（SMS）处理的土壤中这些动态是如何发生的，本研究进行了为期14周的土壤实验，以评估SMS的植物生长促进特性，并与含矿肥改良土壤的处理相比较，监测产生的SMS-土壤群落的演替过程。通过DNA和RNA水平的高通量测序分析细菌和真菌群落。利用计算工具的组合评估了SMS-衍生的类群在土壤中的持久性，以及共生模式和微生物群落结构随时间的变化。
结果表明原核生物和真菌群落在SMS修正后呈现明显不同的轨迹。土壤原核生物群落对SMS处理带来的变化表现出较高的适应性，并迅速趋向于土壤剖面。相比之下，SMS真菌群落在土壤定殖较为成功。SMS处理促进了活跃群落中高度相连部分的真菌参与率，包括源于SMS的真菌类群。本研究观察到高度关联的微生物菌落的存在，由真菌和细菌类群组成，具有复杂有机物降解能力。其中许多类群还与土壤有机质含量和植物产量显著相关，表明这些高度联系的类群可能不仅在群落结构中发挥关键作用，而且在有机肥作用下的植物-土壤系统中也发挥关键作用。
论文ID
原名：Soil prokaryotic community resilience，fungal colonisation and increased cross domain co-occurrence in response to a plant-growth enhancing organic amendment.
译名：土壤原核生物群落适应力，真菌定殖和增加跨域共现响应植物生长促进有机修正
期刊：Soil Biology&Biochemistry
IF：5.795
发表时间：2020.8
通讯作者：F. S. Paula
作者单位：爱尔兰国立大学自然科学学院&瑞安研究所
实验设计
图S 实验流程图
结果
1. SMS作为土壤有机改良剂
在没有其他肥料的情况下，将稳定的SMS作为有机改良剂应用于土壤。之前的研究证明，SMS能够在无土的园艺混合物中支持植物生长并提高植物产量。在本研究的土壤实验中评估了SMS维持意大利黑麦草生长的能力，并进一步研究了这种有机改良剂对土壤生物和非生物特征的影响。在14周的实验中，将结果与经过改良的矿物（M）和未经处理的土壤（U）进行了比较。仅在最初收获（第5周和第8周）的M中，草产量迅速增加，在第8周达到峰值（图1）。在第3次收获时（第11周），有机-高（OH）处理的草产量增加，与M没有统计学差异。在第4次和最后收获时（第14周），OH的产量在统计学上显著升高。随着实验的进行，有机-低（OL）的收率也有所提高，但规模小于OH，表明反应与处理的剂量相关。由于高水平的植物可利用的氮磷钾，特别是氮，预期在M中观察到快速反应，每次收获都无法维持这种对产量的有利影响，并且这种影响会降低（图1）。
由于无机肥料主要由硝酸盐和铵（迅速氧化为硝酸盐）组成，由于硝酸盐的溶解度和流动性，植物未使用的无机肥料会因淋滤或流失而迅速损失。相反，稳定的堆肥产品（例如SMS）富含有机氮，有机氮逐渐矿化，提供了更多“缓慢释放”的硝酸盐源，可以通过浸提减少损失。正如本研究所示，这还有助于提高长期生产力，随着实验的进行，其产量超过了无机改良土壤的产量（图1）。这证明了这种稳定的有机改良剂在一系列农业系统（包括常规管理的系统）中具有潜力，在这些系统中，SMS可用于补充化肥，从而在提高土壤质量的同时提高长期产量。这样的补充系统减少了无机肥料的投入，也代表了实现生物循环经济的可控步骤。有机和矿物处理的植物产量变化不仅证明了有机改良剂的中长期影响，而且还提出了有关潜在机制的问题，这些潜在机制是不同修正剂引起植物生长动态差异的基础。因此，这是一个有趣的模型，可以研究土壤微生物群落对有机肥和矿物肥的响应动态，并认识这些动态如何影响植物-土壤系统。
图1 有机和矿物处理对草产量的影响。在5、8、11和14周（w）后测量草的干重，该值代表每个处理重复10次的平均值±SD（OL，有机-低；OH，有机-高；M，矿物；U，未处理）。表格列出了每个时间点（ANOVA和Tukey检验）的两两比较的p值，p<0.05以粗体标出。
2. 根际微生物群落对SMS修正的响应动力学
为了研究草根际微生物群落在SMS处理后的变化，分别通过16SrRNA及其基因测序来评估原核生物和真菌的多样性和检测潜在活跃的群落，从而筛选出可能对环境变化做出反应的群落。然而，与rDNA相比，rRNA经常被报道具有更明显的反应和较高的环境变化相关性，这在短期实验中尤其重要。在本研究中，微生物输入来自2种不同来源（SMS和土壤），但研究者没有通过DNA或RNA方法评估的群落之间进行定量比较，而是将2个数据集整合在一起，并假设活跃的群落可能会富集在RNA水平。此外，结合DNA和RNA数据可能会提供有关新SMS-土壤混合群落的动态和建立的更可靠的信息。结果表明，无论样品类型或分析处理如何，原核生物群落主要是细菌，古菌占不到1%。SMS基质和所有土壤的古细菌相对丰度在0时均低于0.1％，并且在所有处理中都倾向于随时间而增加，其中纳古菌门占优势。在门水平上，样品之间在细菌组成方面观察到一些差异。U组原核生物群落在DNA（51％）和RNA（60％）组分中均以变形杆菌为主导，其次是拟杆菌，疣状微生物菌和酸性细菌，这与之前的报道一致，即发现根际微生物群落中普遍存在变形杆菌。在SMS底物群落中，变形杆菌仍然是优势菌群，相对丰度分别为27％（DNA）和39％（RNA），而群落中的拟杆菌（DNA-25％；RNA-17％）和放线菌（DNA-18％；RNA-14％）丰度较高。DNA和RNA数据集的差异在分类等级较低时更为明显：在初始土壤群落中，DNA数据集中γ-变形菌（26%）最为丰富，而在RNA水平上，δ-变形菌占优势，平均相对丰度为43%。在0时，SMS处理过的土壤（OH和OL）呈现出混合的土壤-SMS群落特征，在实验结束时，DNA和RNA都与未经处理的土壤更加相似。
子囊菌是所有样品中的主要真菌门，特别是在SMS中，其占OTU的99％以上。在OH和OL的初始群落中，还观察到了SMS中子囊菌的优势地位。与U和M处理的土壤相比，有机改良的土壤（OH和OL）遵循不同的演替轨迹。在整个实验中，所有处理中担子菌的相对丰度都倾向于随时间增加，特别是在活性成分中，但在整个实验中，M和U的相对丰度均高于OL和OH。相比之下，只有在第14周时，在OH和OL中才观察到腐生壶菌的相对丰度显著增加，但这种作用并未反映在RNA数据中。通过NMDS和PERMANOVA进一步分析了群落相似性，结果表明SMS和DNA处理均显著影响土壤原核和真菌群落（图2），这可能是生物强化和有机物输入刺激特定微生物群的综合结果。与之相反，相对于U，M不会显著影响真菌或原核生物群落的组成。多因素分析显示，真菌群落中体现了较强处理效果，而原核生物群落的变化受时间影响较大。这与细菌群落呈现的高更替率是一致的，而真菌的生长模式较慢。此外，本研究还评估了每个处理中的群落如何随时间变化，并观察到来自有机处理的原核生物群落变化最大，而矿物处理似乎在所有数据集中受到的影响较小。
当调查微生物群落多样性随时间或处理的变化时，观察到原核生物多样性受时间的影响远大于SMS修正，而真菌多样性则相反。与U和M处理相比，SMS处理最初降低了原核生物的多样性，但所有处理中的值均随时间而改变。尽管在0时观察到潜在活跃群落的情况有所不同，但这些趋势在实验结束时也趋于均衡。改良后的土壤真菌多样性在实验中也有所恢复，但在DNA水平上仍保持在明显较低的水平。在RNA中也观察到相似的趋势，但是没有统计学意义。之前已证明在秸秆分解过程中，真菌多样性指数比细菌多样性受到的负面影响更大。在0时，SMS处理过的土壤中微生物多样性较低，这可能是SMS提供的优势群体增加的结果。而在实验的早期阶段就已观察到了SMS群落和养分输入对本地土壤微生物的影响，与所报道的其他类型的有机改良剂一致。相比之下，真菌群落可能需要更长的时间来恢复多样性。另一种情况是，SMS传播的真菌可能受到现有的固有资源的青睐，从而维持其优势地位。采用qPCR法测定16S rRNA及其片段的总丰度，正如预期的那样，与U相比，SMS的改良引起原核和真菌丰度的初始增加（图3a，b），这是由于SMS中存在的微生物群的生物增强作用（图3d）。随着实验的进行，SMS处理过的土壤中的总真菌数量有所增加，且U和M并未出现明显变化，但在高丰度的原核生物中未观察到这种作用（图3a，b）。同时，真菌与原核生物的比例在不同的处理方式下有所不同，如经M处理的土壤中真菌的比例有所减少，这与先前的研究表明肥料可促进细菌主导的群落相一致。尽管在所有处理中细菌的优势持续存在，但OH群落倾向于富含真菌（图3c）。正如其他有机改良剂所观察到的那样，需要更长的实验来评估真菌是否成为SMS处理土壤中的优势微生物。真菌主导的土壤被认为会增加碳汇，原因为其周转速度较慢，碳利用效率较高以及真菌生物量中存在更多化学难降解的成分。因此，SMS及其作物的营养价值，可以代表一种改善碳固存的可持续手段。
图2 原核生物（a, b）和真菌（c, d）群落组成在DNA（a, c）和RNA水平（b, d）的非度量多维标度。不同指数：Bray-Curtis；压力：a) 0.042）；b) 0.053；c) 0.091；d) 0.095。t0，时间为0；8 w，8周；14 w，14周。
图3 通过qPCR评估不同处理下土壤中原核生物（a）和真菌（b）的丰度。c) 真菌原核生物的比例；d) SMS底物中原核生物和真菌的丰度。Tukey's检验于图a-c底部显示。时间效应（同一处理范围内）：不同字母（a、b、c）的时间点差异显著；处理效果（同一时间点）：不同字母（a,b,c/jkl/xyz）的处理差异显著。
3. 土壤中SMS微生物群落的持久性
群落组成（图2），丰度（图3）和多样性的结果表明原核和真菌群落演替的途径不同。尽管受到了不同的处理，所有土壤中的原核生物多样性倾向于收敛到相似的状态，并且其群落演替似乎也遵循着类似的轨迹。这些观察结果表明，生物强化所添加的原核生物微生物群可能并没有在土壤中持久存在。同时有迹象表明，土壤原核生物群落对SMS修正所带来的干扰表现出抵抗性，类似于之前对其他有机处理的评估。相反，随着时间的推移，SMS真菌接种的效果似乎更持久。为了研究SMS真菌和原核生物在土壤环境中的持久性，并探索在这些条件下土壤微生物组的适应力，使用源追踪器SourceTracker来估计整个实验中转移到SMS的土壤群落在土壤样本中的比例，即使用SMS和t0的未处理土壤作为向SMS处理的土壤提供生物体的来源。值得注意的是，这2种来源之间的微生物生物量差异很大，SMS中的基因拷贝数（每克干重）比土壤中的多2个数量级（图3d）。因此，在0时，OH中较高比例的菌群组成源于SMS，分别解释了60%以上的原核生物（图4a）和80%以上的真菌（图4c）菌群。有趣的是，当0时分析RNA水平上的群落，发现SMS相关部分约占原核生物群落的40%（图4b），占真菌群落的90%以上（图4d）。这些SMS和土壤来源的比例在原核和真菌组之间是不同的。随着实验的进行，源于SMS的原核生物的相对丰度大大降低，同时土壤衍生的原核生物也随之增加。相比之下，SMS真菌在DNA和RNA水平上都更具持久性，并且随时间的推移仅出现少量减少，表明在土壤中已成功建立（图4），OL处理也观察到类似趋势。最后，来源不明的群落随2个群落的增加而增加，但对真菌的影响较小。在分析过程中，有一小部分（6 -15%）的“未知来源”是单例删除的结果，它们可能代表存在于SMS或土壤中处于休眠状态的非常稀少的分类单元。季节、时间、温度、湿度的变化以及黑麦草的显著生长和相关的根分泌物可能使其上升到可检测的水平。来自SMS的营养素输入也可能提供了更多的资源可用性，从而促进了其相对丰度的增加。另外，这种未知的分类单元可能是通过种子本身引入的，作为种子相关微生物组的一部分，但在本研究中未进行采样。
与U相比，经SMS处理的土壤中放线菌和厚壁菌的相对丰度较高。在0点OH组，放线菌中链孢囊菌科的相对丰度明显提高。尽管在第14周之前其在OH和OL组中相对丰度较高，但与U和M相比，其相对丰度随时间急剧下降。在厚壁菌和芽胞杆菌上也观察到了类似的趋势。相比之下，真菌能完全降解多种复杂多糖，也具有分解木质素的能力，而相关部分在细菌中鲜有报道。具有纤维素降解能力的真菌群是SMS底物的其中一个优势类群，从这些方面来看，毛壳菌科通常与土壤中复杂有机质的降解有关，也是造成未处理和有机处理土壤差异的主要类群之一。实际上，与U和M相比，毛壳菌科在SMS处理过的土壤中占主导地位，随着时间的推移，其相对丰度有增加或维持的趋势。然而，更值得注意的是，其在RNA数据的所有采样时间中表现出很高的相对丰度，均高于50%。而在潜在活跃的群落中，毛壳菌科的相对丰度很高，这表明其在SMS处理过的土壤中更新有机质和释放养分中可能发挥作用。
图4 利用SourceTracker对OH土壤0、8和14周（w）原核生物（a、b）和真菌（c、d）群落的来源比例进行了估算（数值表示平均比例±标准差。a & c-DNA；b &d-RNA）。
4. 响应SMS修正的微生物群落的共现模式
为了进一步调查响应SMS处理的真菌和原核生物的动力学，使用网络分析来可视化分类单元之间的共现模式，并整合了原核和真菌数据，以探讨它们在不同处理条件下在群落结构中的潜在相互作用。尽管许多研究旨在破译环境中的细菌共生动态，但在真菌在微生物网络中的作用方面仍然很少，仅分别评估了真菌类群与其他生物体并存的共生现象。所以本研究不仅研究了有机处理对土壤跨域群落网络的影响，还探讨了这些动力学如何在DNA和RNA水平上发生。此外，使用网络方法探索SMS起源的微生物如何整合到土壤群落中。每个网络都是基于第8和第14周收集的根际样品数据构建的，以涵盖处理内的时间变异性。据报道，某些微生物分类群在群落结构中的重要性可能会随时空变化而改变。因此，跨时间共现模式的研究有助于发现在环境中持续存在的特征，能在微生物组功能中发挥重要作用。
网络分析揭示了整个群落和潜在活跃群落的明显不同（图5）。由RNA数据集构建的网络始终显示出更高的节点数、边数、平均度和平均路径长度。相比之下，DNA网络倾向于呈现更高的模块性和平均聚类系数且交互复杂性低。RNA衍生网络的评估可能使人们能够直观地了解群落的快速动态和更替，不同处理方式对网络拓扑结构的影响在DNA和RNA之间存在差异（图5）。在DNA水平上，M、U和OL网络主要包含连接较差的类群（即低度节点），而在OH中观察到少量的中心节点。在RNA水平上，U的网络出现大量高程度OTUs，其中34个被归为中心。有趣的是，所有这些节点都属于原核生物类群。OL和OH的RNA网络分别含有39个和37个中心类群。但与U不同，它们既包含细菌也包含真菌。因此，SMS处理似乎促进了真菌参与活跃群落的高度连接部分以及与原核生物的连接增加。后者将由分类指数进一步证明，此处仅评估分类单元是否更有可能与分类学相关的相互作用。当计算RNA网络的分类指数来比较结构域水平上的相互作用时，观察到OH处理最低值为0.14，而其他处理OL，M和U的指数值分别为0.24、0.30和0.27，这说明OH组的类群与自身的分类域之外有更多的相互作用。
为了了解SMS处理土壤新形成的群落中，土壤和SMS微生物是如何相互作用的，进一步探索了它们潜在活跃类群的网络。在真菌的中心节点中，观察到毛壳菌科OTU的存在，其中一些是在SMS基质中检出的，但在土壤初始群落中却未检出，这表明这些群体可能起源于SMS。因此，SMS传播的真菌类群不仅可以在土壤中持续生长（图4），而且某些群体似乎也成为潜在活跃群落中高度联系的一部分。相反，在SMS底物群落中未检测到细菌中心，表明它们是原土壤微生物群的一部分。土壤传播的细菌中枢分类单元往往随时间增加其相对丰度，包括以含有纤维素降解菌株而闻名的分类单元，如变形杆菌科和多囊菌科。在群落中具有生态相关作用的中心微生物更有可能发挥关键作用，即可能对群落结构、功能和生态系统过程产生重大影响的类群。一些研究已经确定了与有机质分解和养分转化有关的土壤微生物群落中的关键物种。在SMS处理的土壤中，观察到真菌和细菌中心被分配到已知的类群中，这些类群具有复杂有机物降解能力。这些具有高度连接和功能冗余的类群可能对广泛的过程有较高的影响，如有机物分解。在OL网络中，被鉴定为球墨科的2个OTU丛枝菌根真菌（AMF）也属于高度连接的类群。AMF是共生体，可通过促进养分转移，增加对胁迫的耐受性并改善土壤质量和结构为植物提供多种益处。有趣的是，仅观察到OL中AMF相对丰度的增加及其作为中心类群的出现，验证了AMF在土壤中养分利用率低于植物要求时足以支持真菌生长的假说，这样的条件不仅可以促进植物-AMF共生，还可以增加这些真菌与其他微生物的相互作用。同时，本项研究中检测到的其他中心微生物属于先前被鉴定为根际和其他土壤微生物群中的关键分类生物，包括根瘤菌，疣状微生物，拟杆菌和酸性细菌等。
图5 根际微生物群落共现模式（蓝色，细菌；橙色，真菌；绿色，古生菌。U，未处理；M，矿物；OL，有机-低；OH，有机-高）。节点代表OTU或更高层次的分类单元，线代表2个节点之间显著的共现，节点大小由连接程度确定。
中心微生物通过直接和间接的机制影响整个菌群，基础类群可能会影响其他类群的丰度和活性，从而影响群落的聚集、结构和性能。另外，植物的中心微生物能介导微生物群系和非生物因子之间的相互作用已被证明。研究根际中心类群如何与环境因子相互作用，可能有助于阐明植物-土壤系统的复杂性，并制定植物微生物组管理策略。故本研究揭示了中心微生物的相对丰度如何与OH和M处理中环境因素的变化相关（图6）。2种处理方法中的一些中心微生物与NO3-呈正相关。有趣的是，N和P处理中只有少数中心微生物与NO3-显著相关，而所有的中心微生物均呈负相关。有机质含量主要与OH处理的中心类群（包括所有真菌类群）呈正相关。草产量与ITS：16S rRNA比值呈正相关，说明真菌生物量可能在该体系中对植物生产力起着至关重要的作用。只有OH处理的中心类群与草产量相关。值得注意的是，许多OTU也与OM含量呈正相关，包括土壤和来源于SMS的类群。然而，分解者作为中心类群的存在不仅体现了有机质含量和植物产量的相关性，还可能暗示了这些微生物在SMS处理下的植物-土壤系统中的潜在作用。
以上结果表明SMS修正成功地维持了植株的生长，原因可能是SMS基质提供的营养及其物理特性或微生物接种。此外，在用SMS底物进行有机改良的情况下，细菌和真菌群落在土壤中遵循不同的动力学。数据表明，SMS处理后的土壤原核生物群落具有较高的适应力水平，并迅速趋向于土壤的剖面，而SMS所提供的真菌群落能更成功的在土壤中定殖。一些SMS真菌因其属于高度连接的微生物而可能在土壤群落结构中发挥重要作用。这些真菌与土壤衍生微生物共同形成了中心微生物群，并有可能影响群落结构。最后，部分中心微生物似乎也与植物产量和有机质含量相关。这些发现可以为土壤微生物组管理策略提供初步框架，该策略旨在探索微生物接种物的持久性，土壤微生物的适应力和对土壤群落结构和功能有潜在影响的微生物群。
图6 群落参数与环境因子的系数相关性，检验了OH和M处理中作为中心微生物的OTU与微生物和环境因子的相关性。“B”和“F”分别代表细菌和真菌OTUs。显著性相关（p<0.05）以蓝色（正）、红色（负）表示。
结论
1. 土壤细菌群落对有机改良剂所带来的变化具有较强的适应性。
2. SMS提供的真菌群落在土壤中表现出高持久性，SMS修正不仅促进了真菌在土壤群落高度相连部分的参与增加，也促进了细菌-真菌共现的增加。
3. 证明了植物产量与几个中心微生物的相对丰度显著相关。
评论
越来越多的研究试图弄清施肥系统下土壤中微生物群落的复杂性及其对植物健康的影响。但是，群落构建规则和动态仍然远远无法预测。尤其是当使用有机改良剂时，土壤微生物组对引入的生物和非生物因子的反应可能有很大差异。除营养和物理结构外，有机改良剂还可为土壤提供微生物接种物。这些异源微生物如何在环境中持续存在，如何与土壤群落相互作用并影响关键的土壤功能仍是非常不确定的，而这些问题确实仍然是土壤微生物生态学研究的前沿问题。
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