科研 | Nature Medicine：摄食不足和口服万古霉素对人体肠道微生物组和营养吸收的影响
编译：你知道，编辑：小菌菌、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
关于人体微生物对营养吸收的影响，缺乏直接的证据。我们使用两种干预措施进行了一项扩展的住院病人研究假设这将改变肠道微生物组和营养吸收。
在每个试验中，都测量了stool 卡路里损失，这是营养吸收的一个直接指标。第一阶段是一项随机交叉饮食干预，所有参与者都经历了随机3d的过量和不足饮食。第二组是随机、双盲、安慰剂对照的药理学干预，使用万古霉素口服或安慰剂对照(NCT02037295)。研究对象为27名除糖耐量和肥胖外健康的志愿者(17名男性和10名女性，年龄为35.1±7.3，BMI为32.3±8.0)，其中25人完成了整个试验。基本的结束点是饮食和药物干预对stool卡路里损失的影响。
我们假设stool卡路里热量以百分比表示，则与过量进食相比，进食不足会增加stool卡路里热量摄入的百分比并且口服万古霉素也会使之增加。两个基本的结束点均满足。喂食不足相对于过量进食，万古霉素处理相对于安慰剂来讲，他们有更大的stool卡路里损失。
关键的次要结束点是通过扩增子测序和宏基因组学来评估肠道微生物群落结构的变化。我们观察到，在喂食不足和过量的情况下，肠道微生物群落结构只有轻微的扰动，但在喂食万古霉素后，群落结构发生了更广泛的变化，多样性降低。
两种干预措施均使Akkermansia muciniphila增加，导致了stool卡路里大量减少。这些结果表明，营养吸收对环境的扰动是敏感的，并支持临床前模型的平行相关性，表明肠道微生物组在饮食能量获取中可能的因果作用。
论文ID
原名：Effects of underfeeding and oral vancomycin on gut microbiome and nutrient absorption in humans
译名：摄食不足和口服万古霉素对人体肠道微生物组和营养吸收的影响
期刊：Nature Medicine
IF：30.641
发表时间：2020.04
通信作者：Alessio Basolo;Peter J. Turnbaugh; JonathanKrakoff.
通信作者单位：美国亚利桑那州菲尼克斯市卫生与公众服务部国家卫生研究院国家糖尿病与消化与肾脏疾病研究所肥胖与糖尿病临床研究部，菲尼克斯流行病学与临床研究部;美国加州大学旧金山分校微生物与免疫学学系
实验设计
结果
1.UF和抗生素都影响营养吸收
我们进行了一项连续两个阶段的对照饮食研究(图1)。受试者是被允许的临床研究单元(CRU)呆大约31天(图1)，在此期间，他们被喂食一种维持体重的饮食(WMD) (20% kcal蛋白; 30%kcal脂肪;50%kcal碳水)使之保持稳定的体重(±1%)。总的来说，我们筛选了51位潜在的参与者,其中27位开始有25位完成这项研究(扩展数据图1)。
扩展数据图1. 研究方案图。两名个体在完成研究中过量和喂养不足的部分，并随机加入万古霉素(125 mg QID，每天4次)或安慰剂后，由于个人原因离开研究。
在第一阶段,参与者在随机顺序交叉设计实验中每3 天进食150%的WMD(OF饮食)和50%的WMD(UF饮食)之间有一个3天的清除期。在II期，同样的受试者被随机分为安慰剂组和口服万古霉素组。在性别、年龄、体重、身体质量指数(BMI)、身体脂肪百分比或葡萄糖稳态上，万古霉素组与安慰剂组没有明显差异 (补充表1)。整个研究的参与者都是住院病人，对整个实验过程每天监测，并没有副作用报道,尤其像腹泻或腹部症状。
我们在第一阶段的研究结果表明，卡路里摄入导致了营养吸收的显著差异。根据我们的研究设计，与UF (1,494.2 211.0 kcal d 1)相比，在(4,446.5 547.8 kcal d 1)期间，OF（4,446.5 ± 547.8 kcal d−1）每日摄入的卡路里明显高于UF (1,494.2 ± 211.0 kcal d−1;图2 a)。平均而言，这相当于2,952.3kcal d-1的差异。食物和stool卡路里是通过弹式量热法测量的，这样我们就可以计算出每个人的卡路里损失百分比(100×(stool卡路里/摄入的卡路里))。正如预期的那样,过量进食者每天热量损失的绝对数量明显高于进食不足的个人((257.4 ± 91.2 kcal d−1 versus 123.5 ± 32.4 kcal d−1, Δ = 139.4kcal d−1, P <0.0001, paired Student’s t-test;图2 b和补充表2)。然而, 每天摄入的热量用百分数表示时,相对于OF而言，UF有明显更大的stool卡路里损失(8.9 ± 3.7% versus 5.8 ± 1.9%, Δ = 2.3% per day, P< 0.0001, paired Student’s t-test;图2c和补充表2)，具有强而显著的项目内相关性(Pearson’s r= 0.70, P = 0.004)。与OF相比，UF期间的transit时间更快一些(Δ = −10.6 h, P = 0.0035, paired Student’s t-test;图2 d)。与OF不同的是，在UF中从尿液中每日卡路里损失的绝对量是低的(补充表2)但用热量的百分数表示时，与OF相比，UF又是高的 (扩展数据图2a和补充表2),没有检测到饮食顺序或性别对它的影响(P > 0.07;补充表3)。
图2.饮食干预影响营养吸收。图表显示了23名参与者完成UF和OF研究阶段的结果。两名参与者在UF期间没有可用的粪便测量数据。
扩展数据图2.饮食和药物干预对尿液热量含量的影响。
接下来，我们试图在一项针对肠道微生物群的平行研究设计中比较这些结果。按照我们的研究设计,每天摄入的卡路里是与安慰剂,万古霉素组之间进行比较(图3和补充表2)。当以绝对千卡/天表示时，万古霉素导致stool卡路里损失显著增加的(260.1 ± 66.5 kcal d−1 versus 176.8 ± 79.5 kcal d−1, Δ = 83.2kcal d−1, P =0.012, unpaired Student’s t-test;图3 b)或摄入热量的比例(8.4 ± 1.9% versus 5.8 ± 2.2%, Δ = 2.6, P =0.0069, unpaired Student’s t-test;图3 c)。重要的是，万古霉素组和安慰剂组的transit时间没有差异((P = 0.2, unpaired Student’s t-test;图3 d)。与饮食干预相反, 万古霉素组和安慰剂组之间尿液中卡路里排泄没有区别 (图2 b和补充扩展数据表2), 按性别分层时也并没有观察到差异 (补充表4), 万古霉素对个体的体重变化也没有绝对的差异影响 (Δ = 0.2 kg, P = 0.5, unpaired Student’s t-test)。综上所述，这些结果支持了我们的假设，相对于摄入的卡路里，UF和万古霉素导致了stool卡路里损失 (粪便中测量的卡路里的百分比更大)，这表明两种状态下的营养吸收都有所减少。
图3.药物干预影响营养吸收。来自完成了随机阶段研究的24名参与者的结果。
2. 肠道微生物在UF和口服抗生素作用下的变化
为了确定可能导致观察到的营养吸收差异的候选效应微生物，我们使用扩增子和宏基因组测序相结合的方法，评估了饮食和药理学扰动对肠道微生物群落结构的影响。第一阶段我们测序了在关键时间点的来自于25名参与者的样本,包括试验开始时的基线样本收集,中点样本每3天 UF和OF周期收集,每种饮食干预前后的样本收集和在万古霉素或安慰剂期间三个样品收集(补充表5)。为了检测在整个研究中肠道微生物结构的纵向改变,我们还在第一阶段(16天)每天测序10个被试者的样品,包括在饮食策略之间，stool卡路里损失百分比显示最高差异的5名受试者和另外在stool卡路里损失百分比显示最低差异的5名受试者 (补充表5)。
从我们第一阶段的营养结果 (图2)让我们推测在UF期间肠道微生物群可能是相对缺乏营养的,这可能会导致细菌定植的减少。令人惊讶的是，我们发现相较OF而言，总的定植水平在UF期间明显增加(图4a)。这些差异在stool产量正常化后仍然显著(P =0.005, paired Wilcoxon test)。通过3天UF和OF的干预维持体总微生物群落结构,维持在基线水平的个体间差异 (图4 b-d)。在分析每一个体时,我们可以确定2个个体(10个评估的)之间的不同饮食方式下整体微生物群落结构的显著差异的(图4 e),这可能表明基线肠道微生物群对膳食干预的灵敏度很重要。整个第I期16天的微生物多样性也相对稳定的(图4f);然而，UF处理的最后一天相对于OF处理的最后一天，多样性显著增加(P = 0.04, paired Wilcoxon test)。门或属水平上饮食方式之间相对丰富没有显著差异,除了Verrucomicrobia门类在UF中被显著增加(扩展数据图3)。
扩展数据图3. 在OF和UF之间的门水平相关丰富度。
接下来，我们使用宏基因组测序来确认和延长观察到的肠道细菌相对丰度的变化。在4个关键时间点的18个个体中选择样本，包括基线样本、每个3-d UF期和OF期的中点样本、冲洗期之间的样本和万古霉素组或安慰剂组的样本。总的来说，我们在第一阶段从95个样本中产生了381.7 giga的测序数据(补充表6)。使用成对Wilcoxon检验来鉴定每种饮食的差异丰富的细菌(independentof order)。这一分析揭示了9种细菌，它们在两种饮食之间存在显著差异(图4h和补充表7)，包括在UF过程中对A. muciniphila的高丰度，这与我们基于16S rRNA基因序列分析的结果一致(图4g)。我们还检测到在UF中多个Alistipes物种。
图4.饮食干预对肠道微生物的影响。
与摄入卡路里相反，与安慰剂对照组相比，口服抗生素万古霉素对肠道菌群的影响显著且可重复。而处理组定植水平差异无统计学意义(P = 0.26, unpaired Wilcoxon test;图5a)，16S rRNA基因测序评估了菌群多样性上的有意义的减少(P < 0.0001, unpaired Wilcoxon test;图5 b)。万古霉素对肠道微生物群落结构也有显著影响，超过了先前存在的个体间差异(图5c)。与安慰剂相比，服用万古霉素的受试者的门水平相对丰度有显著变化(扩展数据图4a)。对序列变异的更精细的分析表明，在经过万古霉素处理的组中，在不同的门水平中有几个离散的细菌簇发生了改变(扩展数据图4b和补充表8)。
扩展数据图4. 万古霉素对肠道菌群组成的影响。
宏基因组测序证实万古霉素组和安慰剂组之间存在广泛且可重复的差异。采用非配对Wilcoxon检验分析，发现41种细菌的相对丰度有显著差异(错误发现率(FDR) <0.05)(图5d)，万古霉素组丰度呈下降趋势(31种下降，10种上升)。与我们的16S rRNA基因测序数据一致，这些vancomycin depleted细菌跨越多个革兰氏阳性(Actinobacteria 和 Firmicutes)和革兰氏阴性(Bacteroidetes)门。在万古霉素处理过的个体中，3个Veillonella菌种显著丰富的。我们还在万古霉素组中检测到多种Lactobacillus 和Klebsiella的显著丰富程度，以及一种infects lactobacilli (Lc-Nu)的毒性噬菌体，这与小鼠模型中抗生素诱导噬菌体产生的证据一致。
尽管UF组与OF相比与万古霉素组与安慰剂组相比，两者stool卡路里损失均有所增加，但我们发现这些干预措施对肠道微生物群的影响存在显著差异。UF和OF在门或更细的水平上几乎不产生扰动，而万古霉素导致肠道微生物群落结构的广泛变化。尽管存在这些差异，基于16S rRNA序列变异分析，我们依然能够识别出两种在这两种干扰下持续变化的细菌(图5e): A . muciniphila，一种被认为在肠屏障中起保护作用的粘质细菌，在UF和万古霉素组中是丰富的；属于Lachnospiraceae NK4A136组的一个未知物种，在UF和万古霉素干预期间下降。宏基因组测序证实了UF中A . muciniphila的丰富程度(图4h)，以及万古霉素组A . muciniphila丰度增加的趋势(P = 0.25)。
图5 肠道微生物对口服万古霉素的反应。
3.对UF组比OF组、万古霉素组比安慰剂组中，与代谢性疾病相关的宿主微生物相互作用的机制研究
为了进一步了解与营养吸收相关的特定细菌基因、酶和代谢途径，我们使用HUMAnN2对我们的宏基因组数据集进行了注释。与我们的分类学分析(图4)一致，该分类学分析揭示了UF相比OF对肠道微生物群落结构的轻微干扰，微生物组数据集的功能分析没有显示出饮食组之间在基因家族或代谢途径丰度方面的任何显著差异。相比之下,我们在万古霉素和安慰剂之间从全部的3553 个Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)功能直接同源序列(KEGG Orthology) (FDR< 0.1, 补充表9) 中发现760个丰富的显著差异的基因和基因组,符合普遍的肠道微生物群落结构的变化(图5a-d)。在通路水平有一个更温和的组间区别;只有290个代谢途径中的3个丰富有差异(减少)，万古霉素与安慰剂相比较而言(扩展数据图5)。
扩展数据图5. 万古霉素与安慰剂之间差异丰富的代谢途径。
为了对肠道微生物代谢推断的差异提供更直接的支持，我们评估了血浆短链脂肪酸作为肠道微生物组加工和代谢营养物质能力的标记物，以及涉及营养吸收和肠屏障功能的激素和胆汁酸。这些测量是在每次干预之前和之后进行的。与先前的研究一致，GLP-1和leptin在OF时期显著升高，而leptin和GLP-2在UF时显著降低(补充表10)。作为肠道细菌代谢的主要最终产物，丁酸盐在UF(图6a)和万古霉素(图6b)处理后显著降低，这支持了我们的宏基因组分析，并与干预期间肠道微生物获取营养的能力下降相一致。去氧胆酸，一种次级胆汁酸，在两种干预后也显著降低(图6c,d)。脱氧胆酸升高与肠道通透性增加有关。较低的浓度可能意味着保护肠道屏障和较低的营养吸收。万古霉素还能降低乙酸、丙酸和次级胆汁酸石胆酸的含量(扩展数据图6)，这与口服抗生素对肠道菌群的广泛影响相一致。
图6. 饮食和药物干预后血浆丁酸盐和脱氧胆酸的变化。
扩展数据图6. 口服万古霉素或安慰剂治疗前后血浆醋酸盐、丙酸和石胆酸浓度。
增加stool卡路里损失可能是由于改善肠屏障功能，从而降低肠道通透性。我们测量了两种循环血浆标志物，当血浆标志物增加时，可能表明肠道通透性增加: zonulin；细胞间紧密连接作用的调节器;和脂多糖(LPS)，一种革兰氏阴性菌的产物。用酶免处理后，血浆中zonulin和脂多糖浓度均无变化(补充表10)。OF期间,血浆zonulin浓度增加(Δ= 0.4,P = 0.04, paired
Student’s t-test)但血浆LPS浓度没有变化。万古霉素或安慰剂给药期间，血浆LPS和zonulin浓度没有变化。除了OF期间zonulin的轻微增加，我们没有发现肠道通透性改变的证据。最后，我们评估了万古霉素给药是否影响能量或底物氧化率或调节脂肪储存和葡萄糖代谢的代谢物。(1)血管生成素样4 (ANGPTL4)和脂蛋白脂肪酶活性(LPL) (补充表11);(2) 24小时能量消耗或底氧化(扩展数据图7);或(3)葡萄糖耐量或胰岛素浓度(扩展数据图8) 均无显著差异。
扩展数据图8. 万古霉素组和安慰剂组在随机化前后葡萄糖和胰岛素的浓度。
讨论
在这个两阶段的研究中，我们直接测量了摄入的和stool的卡路里，证明了在两种状态下：UF相比于OF, 口服万古霉素相比与安慰剂，与摄入的卡路里相比，stool的卡路里损失增加。尽管UF和万古霉素对肠道菌群的影响不同，但在UF和万古霉素给药期间，stool卡路里损失均增加。我们观察到UF和OF对肠道微生物群落结构的轻微干扰，而口服万古霉素引起了广泛的变化，降低了肠道细菌的多样性，并使肠道细菌的相对丰度发生了显著变化。在两种干预措施中血浆丁酸盐和去氧胆酸浓度的降低都是常见的，这两种干预措施均导致更大stool卡路里损失。我们的研究通过关键时期的stool收集，采用直接测量stool和尿液的卡路里摄入，并密切监测饮食摄入的一致性。由于参与者都是住院患者，因此我们可以定时收集粪便样本，以便我们能够分析干预措施对肠道菌群丰度的影响。
作为细菌代谢的主要最终产物，丁酸是肠道微生物群处理营养物质有效性或能力的标志。考虑到这一点，我们的结果表明，要么减少向微生物的热量传递，就像UF期间一样，要么由于口服万古霉素，其菌群结构的广泛变化，限制微生物的营养吸收能力，导致粪便热量损失增加。这提供了基于直接测量卡路里的证据，以粪便卡路里的形式计算摄入的卡路里，这使得代谢营养方面在人类肠道微生物上可测量。评估在我们的研究模块所使用的条件下，根据我们的研究结果发现肠道微生物获得了一个额外的~2.5%的绝对卡路里摄入。
我们先前的研究旨在比较瘦的和肥胖的参与者在饮食中摄入相同热量的情况下的粪便热量损失，结果发现UF可以降低Firmicutes与Bacteroidetes的比例，增加粪便热量损失。在瘦个体中，Firmicutes与Bacteroidetes比值的降低是更多粪便热量损失的主要原因，表明了营养吸收的减少。我们目前的研究通过系统的更仔细的提供控制饮食UF和OF以维持参与者体重需要的不同50%或150%。我们证实并量化了UF对增加粪便相对热量损失的作用。然而，与我们之前的结果相反，我们没有观察到在门水平上的显著变化。我们当前研究的差异可能是由于更仔细地控制饮食的条件下,与每个参与者每3 d和UF期间收到精确的饮食,表明非热量负荷因素(例如,不同饮食内容)可能导致我们以前观察到的在门水平上细菌相对丰度的变化。
我们的结果也不同于另一项精心进行的研究，该研究尽管引起了肠道微生物群落结构的广泛变化和代谢物浓度的改变，但没有发现口服万古霉素对粪便热量的影响。我们仔细控制摄入的卡路里，安慰剂组和万古霉素组摄入完全相同的食物。通过测量摄入的卡路里，我们能够计算出粪便中吸收的卡路里的百分比。这是很重要的，因为标记的卡路里反映了代谢卡路里，其准确性对于类似这些更精细的能量平衡研究是有待商榷的。然而，我们发现粪便热量的绝对值和百分比均存在差异。在Reijnders等人的研究中，~80 kcal d-1的实际热量差异似乎与安慰剂组和万古霉素组的粪便热量差异相当。
我们的研究结果为解释粪便热量损失增加的潜在机制提供了见解。这两种干扰(UF和万古霉素)都导致了A. muciniphila相对丰度的显著增加，这被认为是由于其以宿主黏蛋白觅食的能力。在小鼠中，A . muciniphila抵消了高脂肪饮食所产生的粘膜层厚度减少的影响，在不改变食物摄入量的情况下产生体重减轻。A. muciniphila可增加粘膜层的周转率，防止紧密连接的破坏，从而降低肠道通透性。在人类中，一项随机、双盲、安慰剂对照的初步研究显示，在补充了A. muciniphila后，体重和脂肪量有下降的趋势。本研究中巴氏消毒的A. muciniphila cells的使用增加了粪便的能量含量，这与我们的结果一致。需要进一步的研究来阐明A. muciniphila在营养吸收中的作用和机制。
这两种干扰都导致了血浆丁酸盐和脱氧胆酸浓度的显著降低，这与早期的研究结果一致。这两种化合物在胃肠道中起相反的作用，影响肠屏障功能，改变上皮层营养渗透和肠屏障功能。在体外，去氧胆酸使紧密连接蛋白zonula occludenes -1和分泌黏液的杯状细胞减少，增加肠道巨噬细胞极化，暗示去氧胆酸干扰肠屏障功能，诱导肠道炎症。另一方面，丁酸盐对肠屏障功能有有益的影响。体外研究表明，丁酸盐和其他短链脂肪酸会刺激肠屏障的形成，诱导对LPSs的保护。我们的观察表明，热量摄入和抗生素可能会破坏这些代谢产物和其他调节屏障功能的微生物代谢产物之间的平衡，导致营养吸收的改变。我们评估了可以解释观察到的营养吸收差异的替代机制。我们没有发现肠道通透性循环标志物(血浆LPS和zonulin)随着干预的减少而降低营养吸收的证据。粪便中的能量含量也可能受到结肠transit时间的影响，UF的转运时间更快。在大鼠中，transit时间的减少增加了粪便量并抑制了脂肪的吸收。在等热量饮食中，相似的宏量营养素但不同的纤维含量，高纤维相比低纤维饮食(预计增加粪便热量损失)减少了transit时间。对于UF，越快速transit，与肠上皮接触时间越短，吸收越少。
我们承认有几个局限性。我们的样本量很小，但在这个精心控制的住院病人研究中，我们有一个多样化的参与者群体。这项研究的目的是检测UF和OF以及万古霉素与安慰剂在粪便热量排泄方面的差异。我们缺乏检测肠道菌群和粪便热量损失之间关系的能力。此外，我们承认，与能量获取相关的细菌种类、基因和代谢物的直接因果作用需要在动物模型和受控人类干预研究中进行测试。
UF和OF周期只有3 d，如果延长饮食干预时间，肠道菌群可能会发生更剧烈的变化。口服万古霉素是唯一的抗生素测试，所以我们不知道是否其他抗生素在我们的研究设计中也可能影响粪便热量。我们在入院前也没有粪便样本或饮食记录来确定我们的研究饮食与自由生活饮食有多大不同。任何关于营养吸收的机制都是推测出来的，因为我们不能直接评估营养在肠道中的transit。
你可能还喜欢