【技术干货】流式细胞凋亡检测--疑难解答

1、Q：rh Annexin V R-PE 20 tests是BD公司用于凋亡流式检测的试剂盒，产品显示种属为人，请问能否用于大鼠细胞的检测？

A：可以。因为Annexin V是与PS亲和，而PS在不同种属间应该没差异。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

2、Q：用流式作细胞凋亡为什么跟tunel差别那么大啊？？tunel测出来的细胞凋亡率大概有30%而作流式测出来的凋亡率只有2%（阴性对照0.5%）差别好大啊，用的是beckman公司的Annexin V /PI双染试剂盒，实验步骤如下：

（1）胰酶消化贴壁细胞，加培养基中止，离心1000转5min

（2）吸去上清，PBS0.5ml 重悬细胞（因为要送到别处作流式，期间路程约1h，户外温度约37度）

（3）然后加入Annexin V /PI各5微升，避光20min，上机。

请问这是什么原因导致的？

A：我也用这两种方法做过凋亡，是存在两种方法测的凋亡率差别有点大，但还没有大到你这样的程度。双染测的是凋亡的早期事件PS外翻。TUNEL测的是凋亡最晚期的事件DNA片段化。而且TUNEL在检测过程中，把操作损伤细胞和坏死细胞当作了凋亡细胞，而且如果TUNEL是肉眼计数的话，也会有判断上的误差，所以，往往TUNEL作出来的凋亡率高一点。但如果凋亡率达到30%，ladder估计也应该跑的出来。双染虽然是机器操作，但在调试补偿时，人为的影响还是挺明显的，也不是特别的客观。基线稍微左移，你的凋亡率就成倍上升。所以，给你的建议是在经费、时间允许的范围内再多做几次吧。感觉这么大的差异，可能这两种方法都会存在问题。还有，去流式的路上，装细胞的ep管最好插在冰上，拿着冰盒。

3、Q：可以用液氮保存瘤组织块，然后再做流式细胞分析吗？

A：我认为是不能的。因为流式细胞分析要求细胞分散、单个，活性好，这样才能区分死亡、凋亡和活性细胞。组织在冻存、复温的过程中会有大量的细胞死亡，同时经过这一过程的组织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片，不宜上流式检测了，所以用于流式检测的标本最好是新鲜标本，即取材后立即检测，效果最好。

我以前也试图将组织存入-80℃，然后进行流式检测，结果发现后来处理的组织细胞不是粘团就是破碎，根本无法检测。如果你实在找不到可以检测的流式细胞仪，我建议你可以将组织标本进行切片，然后做原位染色，观察组织细胞的凋亡。

我们实验室的肿瘤组织块一部分冻存于液氮用于以后提蛋白做Western或提RNA做RT-PCR，另一部分用10%的甲醛固定用于以后做免疫组化。

4、Q：有关流式前收集细胞的问题1、贴壁细胞做流式前用胰酶消化下来对细胞膜损伤小还是用细胞刮刮下来损伤小？种在板里的贴壁细胞可以先染PI然后再消化下来吗？这样是否可以减小由于消化液造成的细胞膜破损而染上的PI的误差？

A：我想做NK细胞对肿瘤细胞的杀伤实验，用MTT做了很多回，但只有NK细胞的对照组OD值就和肿瘤对照组差不多高了，这样NK细胞杀伤肿瘤细胞后自身的变化对抑制率的影响会很大，所以想用流式来测肿瘤细胞的凋亡。我担心胰酶消化会造成细胞膜的损伤，这样就会有一些细胞因消化的原因染上PI，所以想尝试先染PI，洗掉多余的PI后再用胰酶把细胞消化下来，不知道可不可以。低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2～3次，吊桶式离心机4度1000rpm 3～5min离心，处理得当的话，胰酶造成损伤可以控制在5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。而先加PI不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且PI本身对细胞也是有毒性的，对你的实验结果影响会比胰酶大，个人不建议这样做。

5、Q：做流式细胞过程中，由于不能用胰酶消化贴壁细胞，还有其他什么方法吗？由于293细胞贴壁能力很强，现在要做流式，要把贴在培养皿壁上的细胞消化下来。但又不能用胰酶消化，我试着用1毫升的1mM的EDTA消化20min，结果细胞很难消化下来。最后，去做流式检测结果很差。不知道还有其他什么更好的消化方法，但又不破坏细胞膜的表面结构。

A：不是不能用胰酶消化是不能用含有EDTA的胰酶消化，因为annexinV是Ca依赖的蛋白，所以不能加入EDTA， 防止EDTA螯合了Ca离子从而影响annexinV，进而影响结果。所以你可以用不含EDTA的胰酶，放入温箱内进行消化，时间可以长一点，随时观察细胞情况，避免消化过度。建议用细胞刮子把细胞刮下来，然后用枪吹匀，比消化还简单，而且也避免了胰酶带来的损伤，机械的损伤还是很小的因为细胞大多呈大片大片地被刮下来。

6、Q：流式测凋亡为何左上象限出奇的高？

A：看了你的数据，我觉得第一跟你的细胞状态很有关系，你说对照组中间也有很多死细胞，而且你做实验时也吸上来了，坏死的细胞和凋亡的细胞是不一样的，如果细胞坏死破裂很多的话这时左上象限PI就很高了，再则，PI染的时间5-10分钟就可以了。我做的时候是采用PI和Annexin V分开染，PI先染或离心去掉染液，然后再加结合液和Annexin V10分钟后上机检测。PBS洗的目的有利于Annexin V的结合反应，为了缩短实验时间和较少细胞损失，我一般也就洗一次。最后，我个人的观点是做实验时，细胞状态一定要好的情况下去做，不要勉强，这一既浪费试剂和时间，也往往得不到好的可靠的结果。你做的是贴壁细胞，中间有好多死的细胞，你可以先接种细胞，待细胞贴壁好了，然后再换一次液，这样就把那些死细胞去掉，接下来再加药物。

7、Q：请教做流式细胞仪检测细胞凋亡，那种方法比较好？也比较经济实惠？Annexin V/PI双染色法和Hoechst/PI双染法哪种更好一点？

A：Hoechst/PI染色在流式分析中并不常见。Hoechst需要紫外激发，因此只有在配备了相应激发光源的流式细胞仪上才能使用。我的印象中，不少地方的分选用流式为了用Hoechst分析sp表型的干细胞，配备了此激发光源，但是普通的分析用流式，多半是没有配备的。

8、Q：流式细胞仪检测凋亡如何算是否有统计学意义？

A：用流式检测凋亡时，PI受时间的影响很大，因标记了PI后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致PI的染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大。一般的说明书都会标明，PI在上机前5分钟加，然后在一个小时内检测。根据以前做流式凋亡时的经验，我个人认为，一般每组实验一次可以先做三个复孔，上机前5分钟加PI，最好在半小时内检测完毕。这时可以先分析下三个复孔的差异。等待摸索的实验条件成熟后，每组实验一次可以做6~8个复孔，然后做统计学分析。严格说来，当做出统计学差异时，这样的实验还要重复三次。但是因检测凋亡时，受细胞状态，PI染色时间，流式检测时间，以及每次实验时的误差等的影响外，很难保证能够完全重复出上次的结果，甚至即使在保证了实验条件几乎相同的情况下，每次重复的差异也会出现加大的情况。这时可以适当重复2~3次，尽量使差异减小。

9、Q：如何用Hoechst33342/PI流式检测凋亡？

A：标记完以后，若用流式检测，坏死细胞与凋亡细胞的峰形是不一样的，坏死细胞呈反抛物线，而凋亡细胞呈正常，应是双曲线吧，很容易区分的。关于PI与Hoechst33342作用：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。