提供小鼠体内利用海肾荧光素酶基因标记肝癌细胞生物发光成像的应用（含图示） / 开普饭

海肾荧光素酶( renilla luciferase,Rluc)是一种真核表达的荧光素酶,具有特异性底物腔肠素( coelenterazine ),Rluc的信号分子活性在腹腔注射底物coelenterazine 1 min内达到高峰。Rluc敏感性高、代谢速度快,可用于标记肿瘤细胞。本研究采用Rluc标记肝癌细胞,利用活体成像进行系统直观、定量监测肿瘤细胞在小鼠体内的生长、转移情况。

具体标记方法：

1.构建Rluc基因标记的Rluc-GFP-Hepa1-6细胞:(1）慢病毒包装。取对数生长期的HEK-293细胞,每10 cm培养皿内接种6×10°个细胞,37℃、5%CO,的培养箱过夜。12 h后移去培养液,将Packaging Mix 、慢病毒质粒及Lipofectamine 2000与Opti-MEM培养基混匀后,室温静置20 min后转染HEK-293细胞。孵育6 h后更换含10%胎牛血清的 DMEM培养基,48 h后收集细胞培养上清，2 000×g离心10 min去除细胞和碎片。将病毒原液50 000 ×g离心2h后弃去上清,用Opti-MEM培养基重悬,测定滴度后分装并保存于-80 °℃。(2）慢病毒活性滴度测定。取对数生长期的HEK-293细胞,96孔板内接种8 000个细胞,37℃、5%CO的培养箱过夜。培养基中加2%胎牛血清及8 ug/ml 的聚酰胺,混合均匀后备用。将慢病毒原液用DMEM培养基(含2%胎牛血清和8 ug/ml 聚酰胺）按10倍比稀释,各取慢病毒稀释液100 ul感染96孔板中的HEK-293细胞。96 h后统计表达GFP的细胞数量,病毒滴度为各孔中表达GFP的细胞平均数/每孔慢病毒液体积。(3）慢病毒感染Hepa1-6细胞。取对数生长期的Hepa1-6细胞,6孔板内每孔接种1×10°个细胞,37°℃、5%CO,的培养箱过夜。将慢病毒按病毒滴度=20加入各孔,72 h后置于荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况。

2.流式细胞仪检测及分选:利用流式细胞仪，以GFP为分选标记,GFP激发光波长为488 nm,发射波长为507 nm。分选阳性细胞,多次传代后将

Rluc-GFP-Hepal-6 细胞置于激光共聚焦显微镜下拍照

3.生物发光成像:( 1）细胞生物发光成像。取分选后的 Rluc-GFP-Hepa1-6 细胞,24孔板内分别接种1×10°、5 x 105、2.5 ×105、1.25 ×103、6.25 ×10*、3 ×10*个细胞,37℃ 、 5%CO,的培养箱过夜。24 h后弃上清,分别加入coelenterazine 0.5 ul,进行生物发光成像,曝光时间为5 s。分析生物发光信号强度与细胞数量间相关性。(2）活体生物发光成像。取1×10的 Rluc-GFP-Hepal-6细胞与100 ul PBS混匀制备细胞悬液。常规消毒后,将细胞悬液接种于裸鼠左侧背部皮下,皮下移植瘤的生长潜伏期约7 d。分别在接种后第8、13、18、23、28 d,经腹腔注射150 ul coelenterazine ( 30 mg/ml ）后,立即进行活体生物发光成像。此外,游标卡尺测量肿瘤最长径( a）和最短径（ b ),肿瘤体积(v)=1/2 x ab2。测量至28 d,并观察裸鼠皮下肿瘤是否存在不同程度坏死。探讨皮下肿瘤的发光信号强度与肿瘤体积的相关性。

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。发光信号强度与细胞数量及肿瘤体积间关系采用线性回归分析。

实验结果：

一. 构建并分选 Rluc-GFP-Hepa1-6细胞株慢病毒滴度为9.75× 107TU/ml,按慢病毒滴度=20感染 Hepal-6 细胞,72 h后荧光显微镜下可见 GFP表达。流式细胞仪检测显示GFP阳性率为15% ,经分选后获得阳性率高达95%的 Rluc-GFP-Hepa1-6细胞,激光共聚焦显微镜下Rluc-GFP-Hepa1-6细胞可表达绿色荧光（图1)。

图1Rluc-GFP-Hepa1-6 细胞的鉴定图示

a为流式细胞仪分选后的Rluc-GFP-Hepa1-6细胞;b为激光共聚焦显微镜下表达绿色荧光的Rluc-GFP-Hepal-6细胞(×400)

二、生物发光成像

细胞生物发光成像结果显示,Rluc-GFP-Hepa1-6细胞发光信号强度与细胞数量间有相关性(R=0.999,图2)。

图2不同浓度的 Rluc-GFP-Hepa1-6 细胞生物发光成像图示

活体生物发光成像结果显示,裸鼠皮下接种Rluc-GFP-Hepal-6 细胞后第8 d,其左侧背部发光区域约16 mm',光信号强,光子量为4.0×10° Ph/s。随着观察时间延长,肿瘤体积逐渐增大,其发光信号也逐渐增强,皮下肿瘤的发光信号强度与肿瘤体积存在正相关性（R=0.887,图 3 )。在接种Rluc-GFP-Hepal-6 细胞后28 d时,由于裸鼠的皮下肿瘤发生坏死,尽管肿瘤体积可达1784 mm',但其生物发光信号的强度变化不大甚至出现下降（图3 )。

裸鼠皮下接种 Rluc-GFP-Hepa1-6 细胞后的活体生物发光成像图示

活体生物发光成像技术广泛应用于肿瘤发生、发展、转移、基因治疗,以及干细胞示踪等相关研究。与传统荧光成像相比,活体生物发光成像技术具有更高的敏感度及特异度,其在动物体内能检测到低至10个细胞,而传统荧光成像只能检测到10个细胞。

活体生物发光成像技术能检测到疾病动物模型中肉眼不可见的微小病灶和浅表脏器（如肝、脾、肺)病灶,进行安全、无创的实时动态监测,能准确反映肿瘤生长的实际情况。同时,活体生物发光成像技术以动物自身为对照追踪肿瘤生长变化,不仅节约成本,而且可有效排除个体间差异的影响,为研究肿瘤的发生发展和抗肿瘤药效动物实验提供了科学准确的依据。

生物发光成像需要反应环境中活性氧及ATP参与,只有活细胞内荧光素酶才能发光,因此荧光素酶常应用于肿瘤细胞的生物发光成像研究。在本研究中,结合目前常用的萤火虫荧光素酶( firefly luciferase, Fluc ),我们选取了Rluc基因标记肝癌 Hepal-6 细胞,制备肿瘤模型从而动态监测肿瘤生长情况。在同一实验动物体内。Rluc 、Fluc分别具有其各自特异的底物coelenterazine 、D-luciferin,不存在交叉干扰情况,而且这两种荧光素酶的活性动力学不同。因此,基于以上特点,Fluc可标记抗肿瘤靶向药物,与 Rluc能够在同一个动物体内分别进行生物发光成像,监测抗肿瘤靶向药物与肿瘤的相互作用及疗效。

我们成功构建了Rluc基因标记的小鼠肝癌细胞Rluc-GFP-Hepa1-6。通过细胞生物发光成像验证,Rluc-GFP-Hepa1-6的细胞数量与发光信号间具有正相关性（R'=0.999 )。随后,将 Rluc-GFP-Hepa1-6细胞接种于裸鼠背部皮下,结合活体生物发光成像对裸鼠皮下肿瘤早期微小病灶进行观察，并对肿瘤生长情况进行无创、实时动态监测,皮下肿瘤的发光信号与肿瘤体积存在良好的线性关系(R2=0.887 ),为进一步了解活体动物肿瘤生长和发展情况提供了参考依据。此外,伴随肿瘤生长,部分肿瘤组织发生了出血、坏死等情况,发光信号的强度与肿瘤体积的变化相分离。

皮下肿瘤生物发光模型的建立为我们下一步建立原位肿瘤模型奠定了基础,我们将可通过肝内移植肿瘤细胞,建立原位肝癌模型,利用活体生物发光成像技术检测其生物发光信号强度,动态、定量监测肿瘤生长情况。

综上所述,应用Rluc生物发光成像可成功监测小鼠肝癌皮下肿瘤模型的演进过程,不仅为肝癌体内生长、转移、治疗提供了理想的模型,而且为进一步研究肝癌治疗效果提供了良好、无创的定量示踪手段。

提供小鼠体内利用海肾荧光素酶基因标记肝癌细胞生物发光成像的应用（含图示）

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