基于张仲景学术思想的炮附子 4 种炮制方法的比较研究
基于张仲景学术思想的
炮附子 4 种炮制方法的比较研究＊
彭诗涛，张先灵，袁金凤，张语凡，王鑫，孙美玲，李飞＊＊
北京中医药大学中药学院
摘要：
目的：采用综合评分法比较基于张仲景炮制思想的 4种炮附子饮片质量，为炮附子的现代炮制方法提供依据。
方法：利用 CM-5分光测色计、TMS-Pro质构仪等客观量化检测仪器，以颜色、质地、3种单酯型生物碱含量、麻舌感结合 3种双酯型生物碱含量、7种水溶性生物碱含量以及操作简便性为指标，以药典法炮附片为参照，采用综合评分法从古代干热法、现代烘烤法、清炒法和砂烫法中筛选质量较优的炮附子饮片。
结果：各指标综合评分结果为：现代烘烤法≈砂烫法>清炒法>古代干热法>药典法。现代烘烤法和砂烫法所制备的炮附子均可达到内外皆黄、质地酥脆的传统质量要求。与生附片比较，3种双酯型生物碱含量降低 88.9%~90.5%，3种单酯型生物碱含量增加 255.2%~385.6%；与药典炮附片比较，3种单酯型生物碱和 7种水溶性生物碱含量均显著增加。
结论：现代烘烤法和砂烫法炮附子毒性成分含量低，有效成分含量高，且无胆巴液浸泡工序、操作简便易行、生产周期短。做为秉承张仲景学术思想且便于现代操作的炮附子炮制方法，值得挖掘与传承。
附子为毛莨科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx子根的加工品，其味辛、甘，有毒，归心、肾、脾经，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效[1]。
附子于6月下旬至8月上旬采挖，除去母根、须根及泥沙，习称“泥附子”。现行药典[1]制备附子饮片时均有“泥附子洗净，浸入食用胆巴的水溶液中数日”的产地加工程序。其目的是防止腐烂[2]。研究表明，附子在胆巴溶液中浸泡20天后，能达到防腐的效果，但胆巴含量（以氯化钙计）达到25%~30%，而单、双酯型生物碱均流失70%左右[3-4]。
新乌头碱、次乌头碱在饮片中的适当配比存在是保证附子“回阳救逆”及安全性的关键[5]，本课题组研究发现[6-8]：药典炮附片中双酯型生物碱已检测不到，而无胆砂烫生附片中保留了定量的双酯型生物碱且符合药典对炮附片毒性成分的限量要求，主要药效成分单酯型生物碱较药典炮附片高约4倍。该无胆炮制品具有良好的抗心衰、抗炎和镇痛作用。
张仲景临床应用附子具有“生熟异用”的特点[9]，治疗阳虚重症时，急用生附子回阳救逆，因其大辛大热，取其峻猛、效速而力大持久之性。但生附子过于燥烈而容易伤阴，炮附子性较缓，既可温少阴肾经、温阳散寒止痛，以充实卫阳助水液气化，又可防劫阴之弊。
《伤寒杂病论》中使用附子的经方超过三十方，其中炮用者居多。古代文献记载，“凡用附子、乌头、天雄，皆热灰微炮令坼，勿过焦”[10]，我们对张仲景使用附子的脚注进行分析，认为其炮制对象为生附子，“炮”法的实质是干热，包裹后加热是为了炮制过程中药物受热更为均匀。
课题组前期研究的无胆砂烫生附片采用生附子直接干热法炮制，省略了药典炮附片的加胆巴液的浸泡环节，减少了成分流失，能够达到低毒高效的目的，符合张仲景使用炮附子的理念，值得进一步深入研究。鉴于化学成分是中药发挥疗效的物质基础，故采集四川江油的鲜附子，用秉承张仲景学术思想的古代干热、现代烘烤、清炒和砂烫4种炮制方法制备炮附子饮片，以“内外皆黄”、“坼”作为外观性状标准，以麻舌感结合3 种双酯型生物碱含量、3 种单酯型生物碱含量、7种水溶性生物碱含量以及操作简便性为指标，比较4种炮附子饮片和药典炮附片的质量，分析附子生、炮异用的科学内涵，为传承和发展创新张仲景特色炮制方法提供实验依据。
1 仪器与试药
1.1仪器
sartorius BSA224S 万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；SMARTSENSOR AR882+手持红外测温仪（广州市恒高精艺科技发展有限公司）；CM-5 分光测色计（日本柯尼卡美能达公司）；TMS-Pro质构仪（美国FTC公司）；Agilent1100高效液相色谱仪及工作站（美国安捷伦公司）；SB25-12DTDN型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SHB-3型循环多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52型旋转蒸发仪（上海振捷实验设备有限公司）。1.2 试药 新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰乌头原碱对照品（购于中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号分别为110799- 201106、110720- 201111、110798- 201106、111795-201102、111796-201002、111794-201303）；盐酸多巴胺、鸟苷、腺苷对照品（购于中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号分别为100070-201507、111977-201501、110879-200202），胞苷（购于上海源叶生物科技有限公司，供含量测定用，批号为B20073），尿苷、去甲猪毛菜碱、去甲乌药碱（购于上海同田生物技术股份有限公司，供含量测定用，批号分别为16120622、16110721、16113021）。甲醇、乙腈、四氢呋喃为色谱纯（德国Merck 公司)；其余试剂均为分析纯；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。
生附片、炮附片（购于四川江油中坝附子科技发展有限公司，批号为20160701、20160901）。江油附子药材（购于四川江油），经北京中国食品药品检定研究院张继主任药师鉴定为毛茛科植物乌头Aconitumcarmichaeli Debx.的干燥子根。
2 方法与结果
2.1炮制品的制备 取大锅，在锅内以木柴生火燃烧至明火尽，分别取大小分档的生附子个适量，掩埋在锅内热火灰中，加热至附子表面有裂隙、内外皆黄，取出。制得古代干热品（S1）。
经预试，以炮附子饮片内外皆黄，且表面出现裂隙为标准，确定下列3种炮制方法的工艺条件，分别制备炮附子饮片：160℃烘制得到现代烘烤品（S2）。120℃炒制得到清炒品（S3）。砂温220-250℃烫制得到砂烫品（S4）。
将炮附片（S5）、生附片（S6）和以上各炮制品分别粉碎，过三号筛，备用。
2.2炮制品的质量检测
2.2.1CM-5 分光测色计量化检测颜色 为对比各饮片内外颜色的一致性，采用CM-5 分光测色计分别对其饮片和粉末进行颜色测定。以生附片及其粉末作为标样，对炮附片和其他4种炮附子饮片进行检测，求得差值dL*、da*、db*即代表颜色粉末数据。dL*为明暗度差值，正向趋于亮，负向趋于暗；da*为黄蓝色差值，正向趋于黄色，负向趋于蓝色；db*
为红绿色差值，正向趋于红色，负向趋于绿色。炮附子的性状要求为“内外皆黄”，故选择表征黄色的da*为主要指标。检测结果表明，古代干热法饮片和粉末da*差值为2.85，颜色相差较大；药典法和其他3 种方法饮片和粉末da*差值在0.54之内，颜色较为接近，与主观观察结果一致。说明古代干热法不易控制炮制程度，易致“外焦内生”，其他4种方法仅清炒法饮片局部出现焦斑。药典法、现代烘烤法和砂烫法所制得的饮片内外皆黄，且颜色均匀。
2.2.2TMS-Pro 质构仪量化检测质地 为检测各炮制品的酥脆程度，采用TMS-Pro质构仪，对各饮片进行检测。结果显示，古代干热品所需的剪切力最大，为153.3 N；清炒品次之，为150.5 N；药典炮附片和其他2 种方法剪切力相近，在64.6-72 N 之间。表明古代干热法和清炒法所制得的饮片质地较为
坚硬，现代烘烤法、砂烫法和药典法所制得的饮片质地较为酥脆。主观感受古代干热法与清炒法所制得的饮片部分坚硬，部分酥脆，质地不均匀。药典法、砂烫法与现代烘烤法所制得的饮片质地均匀酥脆。
2.2.3 3种双酯型生物碱和3 种单酯型生物碱的含量测定 按照2015版《中国药典》附子项下检查和含量测定的方法对生品、药典法和4种炮制方法所得饮片中3种双酯型和3种单酯型生物碱进行检测（表1）。
药典规定：附片含3种双酯型生物碱总量不得过0. 020%，含3种单酯型生物碱总量不得少于0.010%。但未有炮附片的量化质量标准。从表中可以看出，生附片中3 种双酯型生物碱总量为0.169 8%，药典炮附片未检出双酯型生物碱，4 种模拟炮附子中双酯型生物碱含量较生品降低幅度达88.87%~93.46%，含量在0.011 1%~0.018 9%，均符合药典附片含3种双酯型生物碱总量不得过0. 020% 的要求。药典炮附片中单酯型生物碱的总量为生附片含量的66.85%，4种模拟炮附子中单酯型生物碱总量为生品的3.6>4.9倍。说明4种模拟炮附片均可达到减毒增效的炮制目的且优于药典炮附片。
2.2.4 7种水溶性生物碱的含量测定
2.2.4.1对照品溶液的制备
取胞苷、盐酸多巴胺、尿苷、去甲猪毛菜碱、鸟苷、腺苷、去甲乌药碱对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶液制成每1 mL 含胞苷0.03 mg、盐酸多巴胺0.04 mg、尿苷0.1 mg、去甲猪毛菜碱0.1 mg、鸟苷0.12 mg、腺苷0.22 mg、去甲乌药碱0.134 mg 的混合对照品溶液。
2.2.4.2供试品溶液的制备 精密称定60℃干燥40 min 的饮片粉末2 g，加水50 mL，回流提取1.5 h，滤过，滤渣加50 ml水，再回流提取1.5 h，合并滤液，减压浓缩至10 mL，加80%乙醇醇沉24 h，回收乙醇至无醇味，用水定容至5 mL，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，作供试品溶液。
2.2.4.3色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18(4.6 mm250 mm，5 μm)；流动相：0.1 mL·L-1NaH2PO4水溶液(A)-50%甲醇(B)，梯度程序：0-25 min，0-1% B；25-32 min，1%-9% B；32-min，9%-35% B；75-95 min，35%-65% B；95-110 min，65%-85% B。柱温：30℃，流速：0.8 mL·min-1，检测波长：280 nm，进样量：10 μL。
2.2.4.4方法学考察
精密度精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积。计算胞苷、盐酸多巴胺、尿苷、去甲猪毛菜碱、鸟苷、腺苷、去甲乌药碱的峰面积RSD均<3%。结果表明仪器精密度良好。
稳定性精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别在制备后的0、2、4、8和12 h进样测定,记录峰面积。计算胞苷、盐酸多巴胺、尿苷、去甲猪毛菜碱、鸟苷、腺苷、去甲乌药碱的峰面积RSD均<3%，结果表明样品在12 h内稳定。
重复性按供试品制备方法平行制备6份供试液，进样10 μL，记录峰面积。计算胞苷、盐酸多巴胺、尿苷、去甲猪毛菜碱、鸟苷、腺苷、去甲乌药碱的峰面积RSD均<3%，结果表明方法重复性良好。
加样回收率取供试品6份，每份1 g，精密称定，分别加入含胞苷14.6 μg·mL-1、盐酸多巴胺2.8 μg·mL-1、尿苷42.2 μg·mL-1、去甲猪毛菜碱25.6 μg·mL-1、鸟苷37.6 μg · mL- 1、腺苷227.8 μg · mL- 1、去甲乌药碱51.6 μg·mL-1的溶液2 ml，按照“2.2.4.2”项下方法平行制备6份供试液，“2.2.4.3”项下色谱条件进行检测，计算胞苷、盐酸多巴胺、尿苷、去甲猪毛菜碱、鸟苷、腺苷、去甲乌药碱平均回收率，结果均在95%~105%范围内，RSD均小于3.0%（表2）。
2.2.4.4 炮制品检测
精密量取7种对照品溶液和供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录保留时间和峰面积，计算各供试品溶液中胞苷、盐酸多巴胺、尿苷、去甲猪毛菜碱、腺苷、鸟苷及去甲乌药碱的含量。检测生附片、药典炮附片和其他4种炮附子中7种水溶性生物碱含量。结果见表3。
实验结果表明，7种水溶性生物碱总量：现代烘烤品>生品>古代干热品>砂烫品>清炒品>药典炮附片，现代烘烤品含量较生品高，其他3种炮制品含量较生品低，推测其可能与炮制过程中温度高低的影响不同有关。
2.3炮附子饮片的综合评分
对各指标进行加权综合评分，评分时以各指标的最大值为参照，将数据进行归一化，再按各指标的重要性给出权重系数。赋值依据：
颜色（M1）：以肉眼观察结合颜色量化测定结果，以饮片内外皆黄、颜色均匀为佳，总分10 分。外焦内生，颜色不均匀者分数逐减。
质地（M2）：以人体主观感受结合质地量化测定结果，以饮片片型完整、质地均匀酥脆为佳，总分10 分。片型不完整、质地不均匀者分数逐减。
双酯型生物碱含量（M3）：以含量测定结果结合口尝微有麻舌感为佳，总分10分。麻舌感强烈或无麻舌感者分数逐减。
单酯型生物碱含量（M4）：为3种单酯型生物碱含量之和。
水溶性生物碱含量（M5）：为7种水溶性生物碱含量之和。
操作（M6）：以操作简单，节省人力物力为佳，总分10分。操作繁琐，生产成本高者分数逐减。
根据各指标对于饮片质量的重要性，以权重系数颜色：质地：3种双酯型生物碱含量：3种单酯型生物碱含量：7种水溶性生物碱含量：操作简便性=0.18∶0.18∶0.18∶0.18∶0.18∶0.1，分别计算综合评分，总分计为100分。评分结果见表4。
综合评分=（M1/M1max）*18 +（M2/M2max）*18 +（M3/M3max）*18+（M4/M4max）*18+（M5/M5max）*18+
（M6/M6max）*10
3 讨论
颜色、质地主观判断结果与色差仪、质构仪检测结果一致，砂烫法和现代烘烤法可达到内外皆黄、质地酥脆的炮制要求。古代干热法和清炒法炮制程度较难掌控，容易外焦内生，且质地部分坚硬，部分酥脆，质量不均一。
药典炮附片双酯型生物碱未检出，单酯型生物碱含量较生品降低。而基于张仲景学术思想，模拟古代干热法、现代烘烤法、清炒法和砂烫法所制备的炮附子饮片双酯型生物碱含量较生品分别降低91.8%、88.9%、93.5%、90.5%，单酯型生物碱含量较生品分别增加297.2%、255.2%、368.0%、385.6%。说明4 种模拟炮制品较炮附片均能达到减毒增效的目的。现代烘烤
法、砂烫法炮制的炮附子饮片口尝微有麻舌感，但古代干热法和清炒法炮制的饮片口尝无麻舌感，说明这两种方法炮制程度较难掌控，容易炮制过度。7 种水溶性生物碱的总量现代烘烤法较生附片增加41.8%，其它3种炮制品较生附片分别降低39.6%、52.7%、41.5%。推测可能与炮制过程中加热温度高低不同有关，其含量增加原因及与药效有何关系仍有待进一步研究。
利用综合评分法对4种方法所制得的饮片进行评分，结果表明现代烘烤法与砂烫法明显高于药典法、清炒法和古代干热法。现代烘烤法与砂烫法均能够达到炮附子外观性状要求，其3种单酯型生物碱含量和7种水溶性生物碱含量均明显高于药典法炮附片，且炮制方法简便易行，节省人力物力，无胆巴浸泡程序，饮片质量较高。可为秉承张仲景思想且便于现代操作的新型附子饮片的炮制方法的传承提供依据。
参考文献
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