冰冻切片免疫组化注意事项.pdf

持了原有的组织形态。在免疫组织化学染色中，能较好地保存细胞抗原的免疫性，同时冰冻切片免疫组化 染色也简化了操作，提高了实验的可靠性。现结合我们所做的实验问题总结如下。 一、冰冻切片 1 冷冻温度及切片厚度 温度过低组织块过冷、过硬，切片易碎；温度过高组织块冷冻不够，不能成片。对不同组织切片温度 的要求不同，据其设置温度。制片时必须做到组织在极短时间内骤冷速冻，才能保证镜下观察组织结构清 晰，细胞形态完好，没有冰晶干扰。骤冷速冻是制作高质量冰冻切片的关键。液氮法速冻，使组织温度骤 降，可减少冰晶的形成。常规免疫组化染色、H E 染色切片厚度一般为5 1 a m 一7 I n n 。 另应注意：( 1 ) 如遇破碎或破溃组织，建议将切片机温度设置在2 2 2 3 ，切片厚度调置为 7 5 t t m 一8 5 t t m ，有利于镜下结构的完整。( 2 ) 如果取材时组织块沾有血液或组织液，这样的标本在常规操 作箱工作温度下制作冰冻切片效果是不理想的，容易使组织内形成冰晶，影响标本质量和镜下形态结构， 切片温度应调置在一2 6 “ C 2 8 ，厚度依组织而异。( 3 ) 因取材、冻存过程中造成组织不新鲜、明显有冰 晶形成或被酒精浸过的，这样的组织切片后镜下结构不清晰宜放弃。 2 固定 染色结果首先取决于组织固定效果，若固定不佳，或固定剂选择不当，不仅结构不清晰，特异性抗原 显示不良，而且整片背景染色深，影响结果的判断。因此选择最佳的固定方法和最适合的固定剂与免疫组 织染色的好坏有着十分密切的关系。固定液有多种，不同的固定液具有不同的作用，至今还没有一种固定 液能用于所有染色的组织固定【z J 。 二、免疫组化染色 染色前必须将切片中的固定液及胶水洗净，从低温冰箱中取出的冰冻切片冲洗前还要室温干燥。尽管 冰冻切片不需抗原修复，但有些实验室己常规作修复，使显色效果较好。另外，温度对本试验影响较大， 为使实验重复性较好，每次实验前使用空调控制室内温度。 1 抗体选择、保存、稀释、孵育 抗体选择。抗体是否符合实验要求，因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造 成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解 决。检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。抗体稀释应遵循“现用现配”的原则，对于P B S 稀 释的抗体一定要当天使用。抗体与抗原的匹配使用的一抗必须和二抗匹配，这一点非常重要。比如一抗是 兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；一抗是小鼠的I g M 抗体，二抗必须是山羊，兔抗小鼠的 l g M 二抗。 抗体的保存。抗体是免疫组化最基本的试剂，因为抗体是蛋白质构成保存或使用不当，不但会造成 浪费，而且试剂变质会出现假阴性结果。所有抗体应严格按照说明书要求存放使用。一般即用型试剂在4 “ C 冰箱保存，尽量缩短滴加抗体时间，并在有效期内使用，对原装浓缩液的抗体，收到抗体后在1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟后再打开管盖进行分装和保存( 如果抗体体积小于5 0 u l ，延长离心时间至5 分钟，以保证全 部抗体均离心下来。比较合适的保存方式是分装后保存在2 0 “ C 或8 0 。对绝大多数抗体来说，保存在- 2 0 是完全足够了。没有任何证据显示保存在一8 0 会有更多的好处。分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体 活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。分装的量以一次实验用完为 好，最少不能少于1 0 u l 每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响复融 后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4 1 2 ，避免再冻起来。抗体工作液应该当天配制当天用 完，在4 “ C 尽量不要超过l 天。绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层，而 不是门上。 抗体稀释及孵育。一般拿到新的抗体后会先用阳性组织做一个剃度，看看最佳反应的稀释比例，选择阳 1 5 8 性结果明显且背景低的浓度。然后选择一个比较好的比例，再检测标本。一抗、二抗应严格按照说明书要 求稀释，一般可用p H 为7 4 的P B S 直接稀释，但实践证明5 小牛血清或5 牛血清白蛋白稀释效果更好。 5 牛血清白蛋白冷冻室中搅拌过夜，p H 调至7 4 ，离心后取上清液，分装，2 0 储存。一抗孵育最好在 4 。C 冰箱过夜( 约1 8 h ) ，二抗及复合物孵育时间不要太长，否则容易过染，按照说明书要求即可。时间和 温度孵育时间和温度对提高抗原抗体的结合率，增强免疫反应有重要意义。孵育时间过短，抗原抗体结合 不够充分，染色较浅。延长孵育时间后特异性免疫反应明显增强，染色明显加深，阳性反应率也明显提高。 2 非特异性着色处理 内源性生物素消除。对于S P 法这种基于亲和素一生物素系统的方法，必须常规内源性生物素消除步 骤，否则会出现定位精确的假阳性，而且背景清晰，难以辨别。但大多数实验室都没有消除内源性生物素 的操作步骤。本实验室采用鸡蛋清稀释液室温孵育2 0 m i n ，以封闭所有内源性生物素，经蒸馏水洗，再用 5 脱脂奶粉溶液室温孵育1 5 m i n ，以饱和剩下的生物素结合位点【3 】。 内源性过氧化物酶阻断。冰冻切片应常规此步骤，H 2 0 2 甲醇混合物室温1 0 m i n 效果较好，时间太长可 能引起某些抗原的丢失和标记灵敏度的降低。 抗体高电荷封闭。为防止标记的部分局部化和胶原纤维的假阳性染色，要用一种不相干的抗体预先处 理，以减少非特异性结合。常用二抗非免疫动物血清室温孵育1 0 m i n 或在4 。C 过夜。 标本染色过程中干涸。标本干涸会造成边缘的非特异性着色。加入试剂后一定要放入孵育盒内( 特别 是胰酶消化) ，每次滴加试剂要适量，防止孵育时间未到，试剂已挥发，出现假阳性；也不能使组织切片 千涸后再加试剂，染色易出现阳性。 3 P B S 冲洗 P B S 的酸碱度对结果至关重要，最佳p H 7 4 。坚持单独冲洗原则，防止交叉反应造成污染。冲洗应温 柔，防止脱片。以往P B S 洗3 次，每次5 m i n ，P B S 消耗量大且占用时间多。据实践经验，在一小烧杯内 柔和地冲洗切片，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好后于切片上再注入P B S ，持 续2 m i n 左右就足够了。一抗及复合物孵育后的冲洗特别关键，充分冲洗可减少非特异结合引起的背景染 色。清洗完毕后应去除清洗液，如果切片上遗留了过多的清洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗 体进行了进一步的稀释。 4 D A B 的使用 D A B 是目前首选显色剂，阳性着色为棕褐色，耐受化学试剂，敏感性高。我们滴加D A B 后在显微镜 下观察显色情况，避免过染，否则背景模糊，待显色完全后用自来水充分冲洗。D A B 的孵育时间和配制方 式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型D A B 试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校 正蒸馏水的p H 值，以确保实验结果的正确性；粉剂D A B 溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过 滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，D A B 保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片 上，因此需将D A B 保存于避光干燥处，要新鲜，现用现配，放置不超过半小时。孵育时间过长也会造成 背景染色。 5 苏木素复染 经常出现过染现象，浆核蓝染过深。根据分化剂能选择性地除去染剂的原理，用0 5 的盐酸酒精分 化数秒，流水冲洗l m i n 蓝化，即清除过染的苏木素，也起到了清洁组织片的作用。 6 对照 每次实验都要设立对照片。如果没有对照，片子是否出现假阳性或假阴性，实验者自己都搞不清楚。 阳性对照片靠积累，阴性对照我们用P B S 代替一抗进行。二抗、三抗等步骤最好不和阴性对照片放在一起 冲洗。 冰冻切片比一般石蜡切片制作要求高、难度大，组织冷冻程度难以掌握。而科研实验中冰冻切片免疫 组化比临床病理诊断的要求更高，要做出组织结构分明、染色清晰且背景低的切片，操作的细节就尤为重 要，此外还要耐心摸索，积累经验。 参考文献 陈瑞庆冰冻切片免疫组化检测大鼠脊髓组织N S E 、N F 的表达们福建医药杂志，2 0 0 9 ，3 1 ( 5 ) ：7 7 蔡翠珠，张红，贾晓云胰腺冰冻切片免疫组化中组织的固定方法比较田中国现代医药杂志，2 0 0 8 。1 0 ( 7 ) ：7 8 7 9 王永军，黄瑾，杨会钗，等免疫组织化学染色中消除内源性生物素的方法研究叨河北医科大学学报，2 0 0 8 ，2 9 ( 3 ) ： 4 5 3 郴4 M A P K 信号通路关键分子在婴幼儿血管瘤组织中的表达 靳耀锋苏宝山王康敏 ( 西安交通大学医学院第二附属医院病理科) 【摘要】目的l 探讨M A P K 信号通路关键分子磷酸化E R K 、p 3 8 M A P K 在小儿血管瘤增生、消退中的作 用。方法：应用免疫组化S P 法检测4 7 例血管瘤( 增殖期2 6 例、消退期2 1 例) 组织中磷酸化E R K ，p 3 8 M A P K 的表达情况。结果。磷酸化E R K 阳性定位于细胞核，其在增殖期和消退期的阳性细胞指数分别为 ( 6 7 7 1 1 2 6 8 ) 、( 2 1 5 4 i - 6 8 5 ) o k ；磷酸化p 3 8 M A P K 阳性定位于细胞核，其在增殖期和消退期的阳性 细胞指数分别为( 8 3 7 8 5 2 5 ) 、( 5 7 7 9 7 6 3 ) ；增生期磷酸化E R K 与p 3 8 M A P K 阳性表达呈正相关， 而消退期呈负相关。结论l 磷酸化E R K ，p 3 8 M A P K 参与血管瘤的增生、消退过程，E R K 通路可介导内皮 细胞的增生和存活，而p 3 8 M A P K 可能主要在消退期传递内、外源性凋亡信号，诱导内皮细胞凋亡。 【关键词】血管瘤，婴幼儿；磷酸化E R K ；磷酸化p 3 8 M A P K ；免疫组化 婴幼儿血管瘤经历了快速增生后可发生自发消退的现象引起了人们的广泛关注，二十多年来对其发生 机制的基础临床研究积累了丰富的资料，但确切的增生、消退机制目前仍不清楚。本研究对婴幼儿血管瘤 增生、消退期磷酸化E R K ，p 3 8 M A P K 进行原位检测及分析，探讨M A P K 信号通路在血管瘤增生、消退中 的作用和规律，为血管瘤预后判断寻找新的检测指标。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 标本来源选取西安交大医学院第二医院病理科资料完整的2 0 0 2 年4 月一2 0 0 8 年1 月手术切除小儿 皮肤血管瘤标本4 7 例，其中增殖期2 6 例，消退期2 1 例；男2 5 例，女2 2 例；年龄1 月5 岁，年龄中位 数为8 月；病变大多发生于头颈、躯干部。 1 1 2 主要试剂p h o s p h 伊删2 M A P K ( T h r 2 0 2 r I y r 2 0 4 ) R a b b i tm A bp h o s p h o - p 3 8 M A P K ( T h r l 8 0 T y r l 8 2 ) R a b b i tm A b ( 美国C e l ls i g n a l i n gT e c h n o l o g y ) ，S P 超敏试剂盒、D A B 显色试剂盒( 福州迈新生物开发有 限公司) 。 1 2 实验方法所有标本均经1 0 福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚5 I n n ，常规H E 染色，免疫组化染色 采用高压抗原修复、S P 超敏三步法，D A B 显色。 1 3 实验结果判断磷酸化E R K ，p 3 8 M A P K 阳性均定位于细胞核，棕黄色颗粒状，每张切片随机取1 0 个 1 6 0 冰冻切片免疫组化注意事项冰冻切片免疫组化注意事项 作者：冯亮， 左中， 王晨， 唐凤仙， 张劲风 作者单位：大连210医院病理科，116021 引用本文格式：冯亮.左中.王晨.唐凤仙.张劲风 冰冻切片免疫组化注意事项会议论文 2011