中国团队新冠肺炎治疗又一进展：发现新候选药物，荣登 Science 封面

SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒 2）是导致全球 COVID-19（冠状病毒病 2019）爆发的病原。目前尚无临床有效的疫苗或特效药可用于预防和治疗 COVID-19 的感染，科学家们正在竞相寻找临床抗病毒治疗方法。其中，一个很有希望的药物靶点是病毒的主蛋白酶 M^pro，它在病毒的复制和转录中起关键作用。

最近，中国科学院上海药物研究所柳红 / 许叶春 / 蒋华良团队、上海科技大学杨海涛 / 饶子和团队及中国科学院病毒所张磊砢 / 肖庚富团队通力合作，开发出基于主蛋白酶 M^pro 结构的新型抗 SARS-CoV-2 病毒候选药物。该研究发表于 6 月 19 日 Science 封面。

（来源：Science）

研究人员在分析M^pro 活性位点结构的基础上设计了两种抑制剂 11a 和 11b，发现两者均强烈抑制 M^pro 的活性，并表现出良好的抗病毒活性。化合物 11a 在小鼠和犬实验中具有较好的药代动力学特性和较低的毒性，表明该化合物是一种很有希望的候选药物。

M^pro 是一个三结构域 (结构域 I 到 III) 半胱氨酸蛋白酶，参与了前体多蛋白的大多数成熟裂解事件。冠状病毒 M^pro 具有位于 I 和 II 区间隙的非典型 Cys-His 二联体。底物中的氨基酸从 N 端到 C 端编号为 - P4- P3 - P2 – P1↓P1′-P2′-P3′，卵裂位点在 P1 和 P1 '之间。尤其是，在底物的 P1 位置几乎总是需要一个 Gln。由于人体内没有 M^pro 同源物，因此 M^pro 是理想的抗病毒靶点。

11a 和 11b 的设计和合成 

M^pro 的活性位点在所有冠状病毒 M^pro 中高度守恒，通常由 S1′、S1、S2 和 S4 四个位点组成。通过分析 SARS-CoV-M^pro（PDB ID 2H2Z）的底物结合袋，研究人员能够设计和合成针对 SARS-CoV-2 M^pro 的抑制剂。S1′位点半胱氨酸残基的巯基通过共价键锚定抑制剂，这对抑制剂保持抗病毒活性很重要。在研究人员设计的新抑制剂中，选择醛作为 P1 中的新弹头，以便与半胱氨酸形成共价键。SARS-CoV-M^pro 抑制剂通常有一个（S）-γ- 内酰胺环，占据 M^pro 的 S1 位点，该环有望成为 P1 的一个良好选择。此外，冠状病毒 M^pro 的 S2 位点通常大到足以容纳较大的 P2 片段。为了测试不同环体系的重要性，研究人员在 P2 中引入了环己基或 3 - 氟苯基，氟有望提高活性。在 P3 中引入一个吲哚基团，与 S4 形成新的氢键，改善类药物的性质。

图 1 | SARS-CoV-2 主蛋白酶（M^pro）抑制剂的设计策略及 11a 和 11b 的化学结构（来源：上述论文）

化合物（11a 和 11b）的合成路线和化学结构如方案 S1 所示。根据文献，起始原料（N-Boc-L - 谷氨酸二甲酯 1）从商业供应商处获得，未经进一步纯化就用于合成关键中间体 3。由 4 和 5a、5b 酸合成中间体 6a、6b。6a、6b 脱丁氧羰基得到 7a、7b，7a、7b 与酸 8 偶联得到 9a、9b 酯。11a、11b 经两步反应合成，酯衍生物 9 先还原后还原，再还原 NaBH4 生成伯醇 10a 和 10b，然后用马丁氧化剂（DMP）氧化成醛 11a 和 11b。

11a 和 11b是 M^pro 的有效抑制剂

重组 SARS-CoV-2 M^pro 在大肠杆菌中表达并纯化。研究人员设计并合成了一种荧光标记的底物—MCA-AVLQ↓SGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH₂，该底物来源于病毒蛋白酶的 N 末端自动裂解序列。

11a 和 11b 对 SARS-CoV-2 M^pro 的抑制活性均较高，在 1μM 时分别达到 100% 和 96%。研究人员使用基于荧光共振能量转移（FRET）的切割分析来确定抑制浓度（IC₅₀）的中值。结果显示，11a 和 11b 的 IC₅₀ 值分别为 0.053±0.005μM 和 0.040±0.002μM，具有良好的抑制作用（图 2）。

图 2 | 化合物 11a（A）和 11b（B）对 ARS-CoV-2 M^pro 的抑制活性曲线（来源：上述论文）

为了阐明 11a 抑制 SARS-CoV-2M^pro 的机制，研究人员在 1.5Å 分辨率下测定了该复合物的晶体结构。M^pro-11a 的晶体属于空间群 C2，不对称单元仅包含一个分子。两个分子（原聚体 A 和原聚体 B）围绕晶体双倍对称轴结合成一个均聚体。每个原聚体的结构包含三个结构域，底物结合位点位于结构域 I 和 II 之间的缝隙中。在 SARS-CoV-2M^pro 的活性位点上，Cys¹⁴⁵ 和 His⁴¹（Cys His）形成一个催化二元体。

电子密度图清楚地显示了化合物 11a 在 SARS-CoV-2M^pro 的底物结合囊中以扩展构象存在。电子密度显示 11a 的醛基的 C 和 SARS-CoV-2M^pro 的催化位点 Cys¹⁴⁵ 形成标准的 1.8ÅC–S 共价键。醛基的氧原子与 S1′位残基 Cys¹⁴⁵ 的骨架形成 2.9Å 氢键，在稳定抑制剂构象方面起着关键作用。而 SARS-CoV-2M^pro 与 11b 配合物的晶体结构与 11a 配合物的晶体结构非常相似，显示出类似的抑制剂结合模式，即两种化合物均占据底物结合囊并阻断 SARS-CoV-2M^pro 的酶活性。

11a 和 11b 的抗病毒活性

为了进一步证实酶抑制结果，研究人员评估了这些化合物在体外抑制 SARS-CoV-2 的能力。实验结果表明，化合物 11a 和 11b 在细胞培养中表现出良好的抗 SARS-CoV-2 感染活性，通过菌斑分析，其半数最大有效浓度（EC₅₀）分别为 0.53±0.01μM 和 0.72±0.09μM。两种化合物均未引起细胞毒性，半细胞毒性浓度（CC₅₀）值均大于 100μM，11a 和 11b 的选择性指数分别大于 189 和大于 139。研究人员还用免疫荧光和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测了 11a 和 11b 的抗病毒活性，结果表明 11a 和 11b 对 SARS-CoV-2 具有良好的抗病毒作用。

此外，研究人员还进一步研究了化合物 11a 和 11b 的药物性能。给小鼠腹腔注射（5mg/kg）和静脉注射（5mg/kg）的化合物 11a 的半衰期（T_1/2）分别为 4.27 小时和 4.41 小时，当给药 11a 时，研究人员观察到最高浓度（C_max=2394 ng/ml）和良好的生物利用度为 87.8%。11a 在小鼠体内的代谢稳定性也很好（清除率 = 17.4ml min^–1kg^–1）。当腹腔给药（20 mg/kg）、皮下给药（5 mg/kg）和静脉给药（5 mg/kg）时，化合物 11b 也显示出良好的药代动力学特性（当腹腔给药和皮下给药时，其生物利用度均超过 80%，当腹腔给药时，其显示出 5.21 小时的较长（T_1/2）。

综合数据表明 11a 和 11b 是很好的候选药物。

责任编辑：余小飞

参考：

http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-SMHX200501006.htm
https://science.sciencemag.org/content/368/6497/1331

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