上调靶抗原表达 促进CAR-T的功能？
限制CAR-T应用的因素中有一个就是CAR识别的抗原表达下调甚至缺失，目前一般会更换识别新抗原的CAR或者是双特异性的CAR，那么有没有用小分子或者其他诱导抗原表达上调来抑制这个逃避呢？
之前的研究发现γ-分泌酶可以直接切除浆细胞表面BCMA的胞外区，而抑制γ-分泌酶后增强浆细胞表面的BCMA表达同时也提高了骨髓中的数量。
2017年SITC年会上Fred Hutchinson癌症研究中心的科学家报道了题为“Gamma secretase inhibition increases recognition of multiple myeloma by BCMA-specific chimeric antigen receptor modified T cells”的研究，发现在临床前模型中γ-分泌酶抑制剂(GSI)可以增强靶向的BCMA的CAR-T对多发性骨髓瘤细胞的识别。如前文提到，BCMA的胞外区被γ-分泌酶切割后，导致原本在多发性骨髓瘤细胞表面普遍表达的BCMA表达下降并且释放可溶性的BCMA到血液循环系统，两者均可以妨碍BCMA CAR-T的疗效，引起BCMA低表达MM细胞的逃逸因此想在体外和体内研究中看下γ-内分泌酶抑制剂(GSI)能否抑制BCMA的移除、增加表面BCMA的水平并且增强BCMA特异性CAR-T细胞的抗肿瘤功能。
结果发现用GSI RO4929097处理后，MM细胞株和原发性MM样本的细胞表面都观察到剂量依赖并可逆的BCMA表达升高同时观察到可溶性BCMA的下降。高剂量的RO4929097 (>3 mM) 可以抑制CAR-T细胞功能，但是低剂量 (0.1-1 mM)足以将细胞表面BCMA水平上调10倍，增强了CAR-T细胞的识别。体内实验部分，在MM的小鼠模型中，RO4929097处理后骨髓及外周血中的肿瘤细胞上BCMA表达升高。而相比未接受RO4929097，用CAR-T细胞并结合间歇性剂量的RO4929097处理植入了MM的小鼠，可以明显提升抗肿瘤效应并延长生存。
由此，已经在临床前MM模型中证明了anti-BCMA CAR-T联合GSI可以增强对肿瘤细胞的识别并提升治疗效应，这些数据将联合治疗转化到临床研究提供了合理支持。因此基于这些结果，该团队在ClinicalTrails上登记一项研究者发起的临床NCT03502577。可以期待在未来2年看到这方面的结果。
再谈一个案例：Bryostatin 1 最早是从海洋苔藓虫中分离的天然产物，被认为主要作用于PKC，在临床上开展过针对恶性肿瘤、HIV和AD的研究。之前有研究发现，在CLL、DLBCL和MCL细胞中Bryostatin 1 能以依赖于PKC的形式提升CD22的表达并增强CD22免疫毒素的杀伤效应。
目前在临床研究中，虽然CD22 CAR-T可以给包括接受anti-CD19免疫治疗后复发在内的r/r ALL患者带来70%的缓解，但是依然会因为CD22抗原密度的下降而引起复发。而在近期在线的CCR上一个研究确认了之前CD22 CAR-T治疗后复发的患者中出现了CD22表达的下降的发现，并且通过体外和体内都实验证明了CD22的低表达下不仅CAR低效扩增降低了CAR-T的效应，还会使得大多数CAR-T细胞处于naïve阶段无法转化成记忆型T细胞，也就是说低表达的CD22降低了CD22 CAR-T的疗效和持久性(下图Nalm6细胞株是制备不同CD22 exp level的parental CD22+ ALL cell line)。
那么提高CAR识别CD22的亲和力能不能促进识别低表达CD22的敏感性呢？可以看出并没有什么LUAN用：高亲和力的CD22v1 CAR-T相比普通的CD22 CAR-T并未能清除小鼠模型中的CD22 low 白血病细胞，同样也发现在不管是处理Nalm6还是CD22 low的白血病细胞后大多数高亲和力的CD22v1 CAR-T处于naïve阶段甚至这一比例比普通CD22 CAR-T还高。
在这里重复出了之前的结果：不管是体外还是体内，Bryostatin 1都 可以上调ALL上CD22的表达。
最后看这种上调能不能增强CAR-T的抗肿瘤效应？
先看体外数据，不管是ALL还是DLBCL细胞株被Bryostatin 1 处理后，都能增强CD22 CAR-T而不是CD19 CAR-T（作为对照，正文未展示结果）细胞分泌IL-2、IFN-γ和颗粒酶B的能力。
另外Bryostatin 1 的靶点PKC本身在TCR信号调控中也起到关键作用，所以还需要看下Bryostatin 1 会不会影响CAR-T的功能：这里用Bryostatin 1 预处理CD22 CAR-T，随后加入ALL或DLBCL细胞，发现IFN-γ下降但颗粒酶B升高，但是综合起来Bryostatin 1 引起的这些差异在体内和体外都没有影响CD22 CAR-T的细胞毒功能。
上面也可以看出，Bryostatin1能影响CD22 CAR-T分泌IFN-γ和颗粒酶B的能力，但是并不会影响CAR-T的功能。
后面，注射过Bryostatin1预处理的肿瘤细胞的小鼠，在接受CD22 CAR-T细胞处理后，脾脏中CD8+ CAR-T细胞种群里观察到中央记忆性和效应记忆性T细胞明显的富集，而Naive T细胞占比显著下降。此外像PD-1、Lag3和TIM3等CAR-T上抑制性免疫检查点的表达也稳定没有升高，也说明Bryostatin1后CAR-T细胞并没有发生耗竭。而图B也显示，Bryostatin1组的小鼠骨髓中CD22 CAR-T占比有所提升。这些结果都证明了Bryostatin1能够增加记忆型T细胞的占比，延长CAR-T细胞的持久性。
进一步的研究中，在肿瘤小鼠注射CAR-T后给予Bryostatin1维持2周的Bryostatin1处理，发现可以获得更为持久的缓解。这一现象在小鼠PDX模型中得到了重复：Bryostatin1可以提升CAR-T对复发型CD22低表达的ALL细胞的清除能力。这些结果提示Bryostatin 1 可以用于VAR-T扩增期间或者是用于CD22 CAR-T治疗后因为CD22下降引起的复发。
这些结果看出Bryostatin 1 可以提高CD22的表达，并延长CD22 CAR-T的持久性，未来在研究中既可以考虑在接受CAR-T前用于prime肿瘤，也可以用于CAR-T治疗复发后的挽救治疗来获得延长的缓解。Bryostatin 1 先前也有很多临床，除了肿瘤，还有AD，整体上还是安全可控，这些结果也支持开展联合治疗的研究。
再简单提个其它的例子（因为还未有其他组重复过上调表达的结果，所以简单提下），也有体外和体内实验显示：Crenolanib可以增强FLT3-ITD+ 197 AML 细胞表面的FLT3蛋白表达，和FLT3 CAR-T形成协同效应：
进攻永远是最好的防守，只是不止于单一形式的战场。