scRNA测序破译以肺亚实性结节为表现的肺腺癌的多细胞生态系统

文章信息

标题：Decoding the multicellular ecosystem of lung adenocarcinoma manifested as pulmonary subsolid nodules by single-cell RNA sequencing
发表时间：27 Jan 2021
杂志：Science Advances（IF 12.530）
作者：Jun Wang，北京大学人民医院，胸外科
DOI: 10.1126/sciadv.abd9738

摘要

在放射学上表现为亚实性结节(SSNs)的肺腺癌（LUAD），其生物学行为比实性LUAD更迟缓。目前对于SSN的转录组特征和肿瘤微环境(TME)仍知之甚少。

这里，我们对16例SNN样本，6例癌旁正常肺组织（nLUNG）以及9例具有淋巴结转移的肺腺癌组织（mLUAD）进行了单细胞测序。我们获得了1180, 293个细胞，0.6 billion 的唯一转录本。结果发现：SSN的肿瘤微环境中主要细胞为细胞毒性自然杀伤细胞/T细胞（cytotoxic natural killer/T cells）。SSN中的恶性细胞具有很强的代谢以及免疫应激特征。SSN中的内皮细胞与mLUAD的比较相似，而成纤维细胞则与nLUNG中的比较相似。

我们的研究提供了SSN的单细胞转录组分析及其TME。这一资源提供了对SSN惰性本质的更深入的认识，并将有助于推进肺癌免疫治疗。

数据与方法

Droplet-based单细胞测序：

  • Single Cell 3′ Library Gel Bead Kit V2  构建文库，
  • Illumina NovaSeq 6000 双端150bp测序。
  • 测序服务由CapitalBio Technology, Beijing 完成，即博奥晶典。

单细胞数据处理：

  • Cell Ranger (version 2.2.0)  得到表达矩阵，参考基因组为GRCh38  。
  • DropletUtils (50) package (version 1.2.2) 去除空的dropets。
  • 接下来使用the Seurat (51) package (version 3.0.0)  进行分析。

过滤标准：

  • genes expressed at a proportion >0.1% of the data and cells with >200 genes
  • 细胞：
    • (i) <500 UMIs (unique molecular identifiers)
    • (ii) >6000 or <200 genes
    • (iii) >10% UMIs derived from the mitochondrial genome.

这些分析基本上都是基于Seruat官网来的：https://satijalab.org/seurat/v3.0/pbmc3k_tutorial.html  。所以，还是要打好基础啊。

多个数据集合整合

参考：https://satijalab.org/seurat/v3.0/integration.html

细胞类型注释和marker识别

FindAllMarkers 函数

定义细胞state打分

使用了markers，可以值得关注：

  • naïve markers (CCR7, TCF7, LEF1,and SELL)
  • 12 cytotoxicity-associated genes (PRF1, IFNG, GNLY, NKG7, GZMB, GZMA, GZMH, KLRK1, KLRB1, KLRD1, CTSW, and CST7)
  • five exhausted markers (LAG3, TIGIT, PDCD1, CTLA4, and HAVCR2) to define naïve, cytotoxicity, and exhaustion scores
  • The resting and active scores of DCs were measured on the basis of the top 30 genes of “LM22”

还有其他的分析如：

  • GSVA
  • CNV estimation （https://github.com/broadinstitute/inferCNV  ）
  • DiffusionMap  和拟时序分析
  • TCGA data  的生存分析

主要结果

1：亚实性结节(SSNs)多细胞生态系统的单细胞转录组分析

16 SSN 样本使用Droplet-based scRNA-seq (10X Genomics)  测序，9例mLUAD和17例nLung下载自公共数据库，将这些样本进行整合分析。总共得到约118,293  个细胞，~0.6 billion  个唯一转录本。在这些细胞中，70,461 cells (59.56%)   来自SSN，26,344 cells (22.27%)  来自mLUAD，21,488 cells (18.17%)  来自nLung。进行质控之后，整合，PCA分析，总共得到了26个细胞cluster。

根据已经经典的基因markers，我们鉴定了10个主要的细胞类型：T cells, natural killer (NK) cells, myeloid cells, B cells, plasma cells, mast cells, fibroblasts, endothelial cells (ECs), EPCAM+ epithelial cells, and erythroblasts.

T细胞的相对丰度从nLung到SSN到mLUAD逐步递增。NK细胞在nLung与SSN中相当，但在mLUAD中更高。mast cells  主要集中在SSN中。与nLung项目mononuclear phagocytes 在SSN与mLUAD中相对减少，B and plasma cells  相对增多。

这个结果说明，SSN展现出一个与nLung和mLUAD不一样的多细胞生态环境。

2：SSN中恶性细胞的标志特征及代谢紊乱

接下来，我们重点关注每一个细胞类型的转录组特征。我们从nLung样本中获得了1997个正常的上皮细胞，并且根据经典基因mariker细分为：

  • alveolar type I cell (AT1; AGER+)
  • alveolar type II cell (AT2; SFTPA1+)
  • secretory club cell (Club; SCGB1A1+)
  • basal airway epithelial cells (Basal; KRT17+)
  • ciliated airway epithelial cells (Ciliated; TPPP3+)

恶性上皮细胞使用inferCNV进行分析，其中，immune and stromal cells作为背景参考。CNV结果与配对的paired bulk whole-exome sequencing  结果一致。

癌变被描述为恶性细胞获得了有利的生物学能力。GSVA分析结果显示，与SSN相比，在mLUAD中的恶性细胞E2F targets, MYC targets, the interferon-r (IFN-r) and IFN-r-response, and PI3K-AKT and hypoxia pathways  上调。与nLung  项目，在SSN中，许多 metabolic pathways  如glycolysis; oxidative phosphorylation; and fatty acid, xenobiotic, and HEME metabolism  发生了上调。最后，我们还使用非负矩阵分解分析了SSN与mLUAD表达谱的区别。

总之，在单细胞分辨率上，我们发现SSN中的恶性细胞表现出强烈的代谢重编程和免疫应激。

3：细胞毒性T细胞和NK细胞在SSN的TME中占优势

57,301 T and NK cells  重新分成了12个亚类，其中35,185 T/NK cells 来自 SSN

  • 5 subtypes of CD4+ T cells  ：(CD4-C1 to C5;CD3D+CD4+) including 1 regulatory CD4+ T cell subtype (CD4-C4; FOXP3+  ）
  • 5 subtypes of CD8+ T cells ：CD8-C1 to C5; CD3D+CD8A+
  • 2 subtypes of NK cells (NK-C1 and C2, CD3D-CD56+TYROBP+)

总之，接下来就开始一堆各种描述了，什么什么marker在哪个群里高表达，最终说明的是：与mLUAD相比，多发性免疫组化染色也显示SSN中NK细胞富集。

4：SSN富含DCs，缺乏TAM亚型

18,380 myeloid cells 重新分成了17个亚类：

  • 9 subtypes of macrophage (MacroC1-C9; APOE+)
  • 2 subtypes of monocytes (Mono-C1/C2; FCN1+)
  • 1 subtype of monocyte-derived dendritic cells (Mono-DCs; MRC1+CD14+)
  • 3 subtypes of conventional DCs (cDCs) (DCs-C1; CLEC9A+,DCs-C2; CD207+ and DCs-C3; LAMP3+)
  • 1 subtype of pDCs (LILRA4+)
  • 1 subtype of granulocytes (G0S2+)

接下来也是一堆描述，主要结果就是SSN中主要的细胞类型是CD细胞，没有TAM亚类。

5：SSN的内皮亚型分布与mLUAD相似

3381个内皮细胞被分成了6个亚类：

  • extra-alveolar capillary ECs (cECs) (Endo-C1; EDN1+SLC6A4+, Endo-C5; EDN1+CCL2+)
  • alveolar cECs (Endo-C2;EDNRB+ IL1RL1+)
  • tumor ECs (Endo-C3; IGFBP7+PLVAP+)
  • arterial ECs (Endo-C4; GJA5+FBLN5+)
  • lymphatic ECs (Endo-C6; PDPN+ CCL21+)

最后得出来的结论是SSN中的内皮细胞分布与mLUAD中相似。

接下来的三个结果主要描述了正常肺和肺肿瘤细胞间的相互作用

  • 第一个，免疫调节的成纤维细胞在SSN中高度丰富

  • 第二个，B和浆细胞在肺TME中富集

  • 参与SSN的细胞间相互作用的特性表现为：
    成纤维细胞和ECs有最多的外向相互作用。与nLung相比，SSN和mLUAD中的ECs和巨噬细胞有更多的外向相互作用，而CD8+ T细胞有更多的incoming外向相互作用。值得注意的是，与nLung和mLUAD相比，SSN中的NK细胞、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞有更多的incomling相互作用，这些相互作用主要来自成纤维细胞、单核细胞、ECs和巨噬细胞。
    为了研究如何招募NK细胞，我们筛选了所有NK细胞上表达的受体，得到了两种高表达受体:CXCR4和CX3CR1。CXCR4的配体是CXCL12，由成纤维细胞和ECs表达。

总结

总的来说，除了第一个和第二个结果比较吸引人，有些意思。其余的又开始走亚群分析的流水线了，跟之前的那篇磨玻璃结节的非常类似（Lu et al. Cell Discovery (2020) 6:69，Single-cell transcriptome atlas of lung adenocarcinoma featured with ground glass nodules ）见以毛玻璃样结节为特征的肺腺癌单细胞转录组图谱。

还有一个地方值得注意的是，这篇文章里，作者采用了公共数据库的单细胞数据进行了整合分析，可以看在正常肺组织，SSN以及具有淋巴转移的LUAD三种环境的单细胞水平的一个变化。

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