长读长单分子实时测序揭示食管鳞状细胞转录组的异质性和复杂性

逆向收费文献阅读小组，因为我个人的放弃，夭折了。

果然，坚持真的好难，我现在都想不通我是如何坚持七八年每日写笔记做分享，积累着1.3万篇教程的？

O(∩_∩)O哈哈~好在是后继有人，在我的生信技能树，生信菜鸟团，单细胞天地，一直都没有分享三代测序相关知识。不过我有预感，这个ISO-seq应该是要在每个癌症里面都发一篇CNS文章的，不仅仅是细胞系这样的前期探索。

下面是学徒做的ISO-seq在食管癌细胞系文章解读

文献题目：

Long Read Single-Molecule Real-Time Sequencing Elucidates Transcriptome-Wide Heterogeneity and Complexity in Esophageal Squamous Cells长读长单分子实时测序揭示食管鳞状细胞转录组的异质性和复杂性

摘要:

食管鳞状细胞癌是癌症死亡的主要原因。绘制转录景观图如异构体、融合转录本以及长非编码RNA等对了解恶性肿瘤过程的调控机制具有重要意义。然而，常规的短读长RNA-seq很难发现整个多腺苷酸化的RNA分子。因此，将单分子实时测序（single-molecule real-time sequencing，SMRT sequencing）与RNA-seq相结合，产生高质量的long reads，并研究食管鳞状细胞的转录过程。与最新版本的人类转录组注释(Ensembl 38 release 91)相比，单分子实时数据发现了许多未被注释的转录本、已知的新亚型和长基因间非编码RNA(lincRNAs)。通过与lincRNA注释整合，从单分子实时测序结果中发现了1,521个食管癌特异性lincRNAs。KEGG和基因组富集分析表明，这些lincRNAs及其靶基因参与了多种癌症信号转导途径。异构体分析（Isoform usage analysis）揭示了不同的可变剪切模式，这些剪切模式能够从临床样本中重现或者得到以前研究中验证。通过严格的搜索标准，检测到了多个转录物融合（transcript fusions），这些转录物在目前的基因融合数据库中没有记录，也不容易从RNA-seq中鉴别。通过Realtime PCR和Sanger测序验证了两个新的融合转录本。总体来说，长读长单分子测序很大程度上拓宽了对食管细胞全长转录组的认识，并对癌变过程中的转录多样性提供了新的认识。

研究背景

  1. 什么是食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell cancer，ESCC）？为什么要进行转录组研究？

食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell cancer，ESCC）是一种严重的恶性肿瘤，具有预后差，死亡率高的特点。目前大规模测序研究揭示了ESCC患者之间存在基因组异质性，阻碍了有效靶向疗法的开发。虽然基因改变导致了肿瘤的发生，但如何影响转录进程并最终导致恶性肿瘤的表型仍尚未被了解。为了找到改变了的信号通路和新的功能转录物如长基因间非编码RNA（lincRNAs），在过去的几年里，进行了很多基于短读长的转录组研究。

  1. 目前测序大致分为二代测序和三代测序，在本研究中为何不使用二代测序？

典型的二代RNA-seq能捕获大量连续的短读数（约100-250 bp），并通过统计建模的方法重构转录本。因此，很难完全从5′到3′端构建RNA分子，也很难注释新的亚型或剪切体。

  1. 为什么使用三代测序？

PacBio单分子实时(SMRT)平台属于三代测序平台，能够对几千个碱基对的长圆形共识序列进行测序，并有机会捕获全长转录本。此外，PacBio SMRT还开发了混合测序的算法，利用高准确度的短reads来纠正SMRT测序的错误，提供了一个强大的工具来研究细胞中的转录情况。

  1. 本研究的主要内容和研究结论？

选取了1个正常永生食管鳞状上皮细胞系和4个ESCC细胞系，在转录组水平上研究了细胞的异质性。利用混合PacBio SMRT平台，对5个食管细胞系进行了从头测序，产生了约210Gb的clean data和约2,000,000个full-length nonchimeric (FLNC) reads。所有这些FLNC读数都具有清晰的5′和3′ mRNA结构，平均长度大于2.5 kb，非常适合用于完整转录物结构的研究。我们发现了许多新的转录本，如异构体、食管癌特异性lincRNAs和融合转录本等；我们还对癌细胞和正常食管细胞之间的可变剪切（AS）特征进行了整理，揭示了食管癌细胞的异质性和复杂性。

研究方法

研究流程

1. 样本来源

  1. 疾病组样本：患者来源细胞系KYSE140（中度）, KYSE510（轻度）, TE5（重度）和TPA诱导的恶性转化肿瘤细胞系（Shantou human embryonic esophageal carcinoma ，SHEEC）
  2. 对照组样本：永生化食管鳞状上皮细胞系(SHEE)

2. 构建文库测序

  1. 分别逆转录合成cDNA构建文库

3. 原始数据处理和参考基因组比对

4. 基因结构分析和新转录本注释

  1. 利用GMAP导出BAM格式文件和GTF格式基因组注释确定基因和转录本结构。利用Abdel-Ghany等人（https://doi.org/10.1038/ncomms11706）描述的方法分析长读长簇与基因模型重叠以找到新的异构体。
  2. 将TSS与CAGE启动子标签和表观遗传标记进行比较。
  3. 通过Diamond BLASTX注释蛋白/肽数据库中的未映射转录本和新转录本。
  4. 通过Hmscan软件(http://hmmer.org/download.html)对Pfam数据库进行了新型转录本检索。

5. 可变剪切模式分析

  1. 通过SUPPA对可变剪切（AS）进行分析, 利用Score D量化细胞之间的差异性。

6. lncRNA pipeline分析

  1. SMRT产生的转录本由CNCI，PLEK，CPC，Pfam-scan预测转录本的编码情况。过滤任何一工具预测具有编码潜力的转录本，剩余的lincRNAs为候选者；
  2. 从Cabili’s reference set中下载补充文件（https://doi.org/10.1101/gad.17446611) 筛选lincRNAs，不在SHEE细胞和Cabili’s reference set中表达的lincRNAs被认为是食管癌细胞特异性lincRNAs。
  3. 基于使用共表达和共定位模式方法预测lncRNAs的相互作用靶基因。通过计算lncRNAs和编码基因之间的表达相关性。将皮尔逊相关系数>0.95（p <0.001）且位于在lncRNA上游或下游100k的基因确定为该lncRNA的靶基因。
  4. 从miRBase数据库(http://www.mirbase.org)下载microRNA(miRNA)发夹序列，并与食管癌细胞特异性lincRNA的序列进行blast比对，确定潜在的前microRNA。

7. KEGG富集分析

8. 转录融合物检测及与数据库中已知或RNA-Seq预测的融合物比较

  1. SMRT转录本根据以下标准确定为转录本融合物：(1)SMRT转录本被映射到两个或两个以上长距离范围的独立位点上，且每个位点必须映射至少10%的query transcript;(2)总合并配准覆盖率至少为99%;(3)每个映射位点之间的最小距离在100 kb以上;(4)发现至少有两个Illumina reads跨越交界处。符合上述所有标准的SMRT转录本被视为融合转录本。染色体中各位置之间融合概述在R包 "RCircos "中均有描述。
  2. 利用STAR-Fusion（默认参数）检测Illumina RNA-seq reads的转录本融合（https://github.com/STAR-Fusion）。根据比较跨越交界处的Illumina RNA-seq读数(以s表示)和与其相邻的两侧读数(分别以a和b表示)，通过a/s<2∩b/s<2标准筛选融合转录物，然后人工检查，进行后续实验验证。为了将检测到融合物数据库中的预测进行比较，先将gene symbol转化为Ensemble Ids (ChimerDB 3.0中使用)；然后，将匹配的基因作为结果。

9. 融合转录本的验证和测序

  1. 实时PCR和Sanger测序

研究结果

1. 食管细胞的全长转录组测序结果

  1. SMRT数据集质量良好

2. 食管细胞中全长转录本特征

2.1 从全长转录本中发现的新基因和异构体

  • 使用GMAP将SMRT reads比对人类Ensembl 38 release 91基因组。平均比对率为90%，每个食管鳞状细胞转录本唯一比对到参考基因组的比例为80%。

  • 短读长Illumina RNA-seq reads通过HISAT2 mapper比对到参考基因组的比对率**>92%**

  • 80％ SMRT转录物是新基因或已知基因的异构体

  • 有50%的TSS与FANTOM5 CAGE数据集中的对应物在10 bp以内。TSS与三个表观基因组标记物的距离更近，大部分的平均距离为1 bp，证明了全长转录的有效性。

  • 超过85%的转录本的蛋白质产物可以在数据库中至少匹配一次，表明许多新转录本确实被翻译成了蛋白质

    证明多个正交数据集能够确认所检测到的转录本可能是全长的

2.2 发现食道癌细胞特异性lincRNAs

  • 总计在食管癌细胞中发现1,521个特异性lincRNAs。file
  • 预测lncRNAs调控靶基因，发现在癌症相关信号通路和细胞基质外受体相互作用中显著富集，这表明相互作用的lincRNAs可能具有类似的生物学功能。此外，通过与已知的miRNA发夹序列与lincRNA序列比对，发现了37个潜在的前miRNAs。file

2.3 鉴定食管细胞中细胞特异性异构体

  • 跳过的外显子（SE）是所有食管细胞中所有AS类型中最丰富的，与之前的研究结果一致。SE是人类基因组中最普遍的AS机制。相比之下，互斥性外显子只占所有AS的5%，是最不常见的AS类型。与其他四种肿瘤细胞相比，正常样细胞SHEE中的AS没有特别的偏好和排斥。
  • 前500个差异拼接基因在三个Gene Ontology (GO) term中显著富集，分别是** “DNA repair,” “cellular response to DNA damage stimulus,” and “positive regulation of GTPase activity”（FDR≤0.05)**file

2.4 食管细胞中转录物融合的鉴定和验证

  • 全长SMRT读数中鉴定出1 972个转录物融合。
  • KEGG通路富集表明，融合基因偏重于RNA加工（即splicosome, ribosome, and RNA transport）和癌症信号通路（focal adhesion, cell cycle, and apoptosis）相关的生物学功能。
  • 通过SMRT与RNA-seq转录本融合比较结果表明SMRT能发现更多的融合。
  • SMRT数据中发现的基因融合与ChimerDB 3.0中数据进行比较，在TE5、SHEE、KYSE510、KYSE140和SHEEC中分别只发现了2个、3个、2个、2个和1个相同的融合，说明从长读长中发现的大多数融合是新转录本融合。
  • 通过实时PCR和Sanger测序，验证了两个新的转录融合物，分别是**ring finger and CCCH-type domains 1–aldo-keto reductase family 1 member B10 (RC3H1-AKR1B10)**和NEK9-TTC21B。
  • 重点关注RC3H1-AKR1B10，RC3H1-AKR1B10这种转录融合物在食管细胞中表达不同，在正常样SHEE细胞中表达最低。RC3H1蛋白由一个Roquin结构域组成，该结构域是构成 decay element-dependent RNA binding所需的。在Roquin域的N端和C端，都具有核苷酸结合的位点。RC3H1含有两个锌指基团。AKR1B10编码aldo/keto reductase，能有效地还原脂肪族和芳香族醛。RC3H1的最后3¢非翻译区外显子与AKR1B10的第一个5¢非翻译区外显子融合，因此，预计融合后的蛋白将保留来自两个亲本基因的完整功能区。用默认参数Blast将两个融合序列与ESCC患者的RNA-seq数据集比对但未能从这些临床样本中找到阳性结果。

结论

目前，测序技术发展迅速。结合PacBio SMRT测序平台与短读长测序，发现了大量的全长转录本，并显著增加了食管细胞的基因和同工型注释。具体来说，我们对AS多样性、癌细胞特异性lincRNAs以及新型转录物融合的检测等方面的研究，启发了目前对食管细胞癌变过程中转录异质性和复杂性的认识。

思路分析

思路研究
关于是否组建群聊

我们其它NGS技术都有交流群，如下：

但是这个将单分子实时测序（single-molecule real-time sequencing，SMRT sequencing）与RNA-seq相结合的ISO-seq就有点麻烦，因为我一直没有这方面项目，所以没有来得及研发它的数据分析流程。

大家可以留言讨论这方面需求，是否有必要组建微信交流群？

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