科研 | 广东药科大学：转录组学和代谢组学分析揭示了苯丙氨酸类化合物在桂皮和肉桂中的积累差异
编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
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桂皮是月桂科的一员，是一种主要的食用香料，同时也是传统草药。中国药典对肉桂决明子有3种描述：（1）Rougui，Cortex Cinnamomi属于干燥的肉桂决明子干树皮、该树皮在秋天剥落并用于抗炎，镇痛，和胃功能；（2）桂枝是干燥的决明子幼枝，于夏季和春季采集，用作风湿性和流感性疼痛的解热镇痛药；（3）Rouguiyou，油茶肉桂，是一种精油，是通过将干燥的决明子叶，茎皮和树枝进行蒸汽蒸馏而产生的，并用作胃和镇痛药。其精油的肉桂醛含量至少为85％。桂皮目前用于饮料，调味料，化妆品，食品和香精的生产中，以及化学和制药行业的使用。因此，它已成为具有高经济价值的主要自然资源之一。 桂皮是精油的主要来源，尤其是其叶子、树枝和茎皮。已经对决明子皮的精油进行了广泛的研究。肉桂花精油的化学成分已有报道，桂皮油富含肉桂酸、肉桂醛、丁子香酚、香豆素、类黄酮以及原花色素。这些成分已被证明具有多种活性，例如抗过敏、抗癌、抗菌、抗氧化剂、抗炎、抗溃疡和免疫调节作用。先前的研究表明，肉桂中的酚类和多酚类化合物参与自由基清除或具有抗氧化活性。但是，肉桂的精油成分主要由苯丙烷占据主导，而肉桂醛为主要成分。较早的研究表明，肉桂决明子精油中的肉桂醛含量为33.95％至87.23％。肉桂Macrophyllum Chu是决明子的一种变种。同时，肉桂油中的香精油，特别是肉桂醛含量，说明其独特的味道和气味。但是，决明子虫合成苯丙烷类化合物的机制仍然难以确定。 RNA测序（RNA-Seq）是发现参与药用植物次生代谢产物生物合成的基因的有效工具。高通量RNA-seq是一项灵敏有效的技术，可以揭示植物中全面的基因变化。最近，转录组测序已在高等植物上进行了重要的先进分子水平研究。但是，关于决明子转录组分析的报道很少。此外，代谢组学的应用已允许鉴定与草药相关的代谢途径。已经基于代谢网络，功能和途径描述了通过代谢组学分析鉴定的代谢物。此外，代谢组学和转录组学的整合有助于阐明重要代谢途径的生物合成机制。因此，这两种技术被用来分析肉桂决明苯基丙烷类生物合成途径。在这项研究中，决明子和决明子变种之间的树皮、分支和叶片中的转录组和代谢组学应答此外，研究了黄酮和苯丙烷类化合物（其精油的主要成分）的合成中所涉及的各种信号传导途径，从而为揭示两个决明子品种中活性成分含量的差异提供了有价值的信息。
论文ID
原名：Transcriptomics and metabolomics analyses reveal the differential accumulation of phenylpropanoids between Cinnamomum cassia Presl and Cinnamomum cassia Presl var. macrophyllum Chu
译名：转录组学和代谢组学分析揭示了苯丙氨酸类化合物在桂皮和肉桂中的积累差异
期刊：Industrial Crops and Products
发表时间：2020.2.26
影响因子：4.191
通讯作者：杨全
通讯作者单位：广东药科大学中药学院
DOI号：10.1016/j.indcrop.2020.112282
实验设计
在中国广东省茂名区选取七年生的“肉桂决明子”（CK）和“肉桂决明子变种”。采集叶子，茎皮和树枝并在液氮中速冻，进行转录组学和代谢组学分析。
结果
1 决明子（CK）和决明子变种(Var)之间的生理差异
Var显示出与CK在可溶性糖含量上的显著差异。在树皮、树枝和叶子中，Var的糖含量分别比CK高1.3、1.2和1.9倍（图1A）。但是，Var和CK之间的可溶性蛋白质含量略有不同。叶片中Var的蛋白质含量比CK高1.2倍（图1B）。树皮中的精油含量Var的变化量比CK高近2.0倍，但叶片中的Var的变化量却比CK低2.4倍，并且分支中的Var和CK之间没有差异（图1C）。出乎意料的是，在树皮、树枝和叶子中，Var的总黄酮含量分别比CK高1.1、1.3和3.2倍（图1D）。数据表明两个决明子变种具有不同的生理特性。
2 Var和CK之间的代谢差异
为了探讨CK和Var之间代谢物组成的差异，使用非靶向代谢组学方法进行了代谢组学分析。用PC1××PC2分数图对树皮和叶片进行PCA分析的结果将CK与Var区分开（图2A和C）。树皮的PC1（38.06％）和PC2（16.31％）有效地将CK与Var分开。此外，根据PC1（38.58％）和PC2（24.25％）值区分CK和Var叶。但是，在分支中未观察到PC1和PC2的显著差异（图2B）。为了确定CK和Var之间显著变化的代谢物（SCM），分析了树皮、树枝和叶子的六个生物学重复（图2D）。Var与CK相比树皮中上调代谢产物的数量要多于下调代谢产物，但是在叶片中却观察到相反的情况。然后，进行KEGG途径富集分析，Var和CK之间的SCM比较显示丰富了与倍半萜和三萜、二萜、苯丙烷和类黄酮的生物合成有关的途径（图2E）。
3 Var和CK的差异表达基因（DEG）分析
为了鉴定Var和CK之间的树皮、树枝和叶片中的DEG，对每个品种（CK和Var）的三个独立重复进行了RNA-seq分析，以分析分子机制。使用与代谢谱分析相同的材料进行转录谱谱分析。结果，经过严格的质量检查和数据过滤后，通过cDNA文库测序，生成了超过7 GB的数据，Q30的百分比> 94％（补充表S2）。根据这些数据，总共鉴定出167,404个单基因，平均长度为100 bp，N50长度为1248 bp，表明测序结果具有较高的质量，因此可用于后续分析。使用qPCR实验基于13个基因的表达模式验证了RNA-Seq数据。观察到qPCR与RNA-Seq之间的高度相关性，表明转录组数据的可靠性。 分别比较Var-barks与CK-barks，Var-branchs与CK-branch，Var-leaves与CK-leaves的成对比较，分别确定了约95,289（上调41,053;下调54,236），445,64（上调18,009; 26,555）下调）和69,950（上调42,846；下调27,104）DEG（图3A）。对于这些DEG，总共有18,208个是Var-barks / CK-barks DEG和Var-branches / CK-branchs DEG，37,828个是Var-barks / CK-barks DEG和Var-leaves / CK-leaves DEG，以及15,716个是Var分支/ CK分支DEG和Var-leaves / CK-leaves DEG。 Var-树皮/ CK-树皮、Var-分支/ CK-分支和Var-叶/ CK-叶共享12,260个DEG（图3B）。值得注意的是，在对Var-树皮/ CK-树皮、Var-分支/ CK-枝和Var-叶/ CK-叶的DEGs进行成对比较的过程中，KEGG通路富集分析都在几个代谢过程中进行，包括苯丙烷类生物合成，类黄酮生物合成，光合作用-天线蛋白和光合作用（图3C）。
4 与CK相比Var的树皮、树枝和叶片中的光合作用和苯丙烷类生物合成的变化
这项研究旨在阐明造成Var和CK之间差异的机制。获得的大多数DEG与苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成以及光合作用有关，这促使我们进行了更深入的分析。光系统由外围天线和光合反应中心组成。大约73个与光合作用反应中心有关的基因，包括PSI和PSII复合物，细胞色素b6 / f复合物（PetA和PetC），光合电子传递（PetE，PetF，PetH和PetJ）以及F-树皮、枝条和叶片的ATP类型（ATPase-a，ATPase-b，ATPase-c，ATPase-beta，ATPase-delta和ATPase-alpha）几乎上调。此外，苯丙氨酸氨裂合酶（PAL）催化肉桂酸的形成，然后将苯丙氨酸途径分为两个分支：类黄酮和苯丙氨酸代谢途径（图5）。 PAL在Var中的表达在树皮中显著高于CK，在树枝中略高，但是在叶片中显著较低。 4-Eoumarate辅酶A连接酶（4CL）在苯丙酸类代谢中的羟基肉桂酸生物合成过程中，在产生辅酶A（CoA）酯中起着核心作用。在树皮中，其在Var中的表达明显高于在CK中的表达，在树枝中略高于CK，但在叶片中无差异。这项研究的结果表明，肉桂酸和香豆碱合成中最重要也是最后一步的肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）和β-葡萄糖苷酶（bglB）在Var中的表达高于在树皮中的CK。在叶片的Var中表达比在CK中低。这可以在很大程度上解释肉桂醛和香豆碱在Var的树皮中的大量积累，但在叶片中的含量低。此外，与类黄酮途径相关基因的基因表达分析表明，编码查尔酮异构酶（CHI），肉桂酸4-单加氧酶（C4H），查尔酮合酶（CHS），黄烷酮3-羟化酶（F3H），类黄酮3'-的mRNA在树皮和叶片中，Va中的单加氧酶（F3'H），二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）和花色苷合酶（ANS）均比CK上调，但其分支中的含量略高，这表明Var和叶之间的含量差异显著（图5）。
图4.Var和CK之间与光合作用及光合作用-天线蛋白相关的差异表达基因（DEG）的热图。
图5. 树皮、树枝和叶子中Var和CK之间的苯丙烷类生物合成途径中的基因的转录谱分析。
5 转录因子（TFs）与VAR中代谢物的差异积累有关
转录因子作为分子开关，响应不同的胁迫而控制各种生长和发育过程。此外，bHLHs和MYBs充当拟南芥中与苯丙烷途径相关基因表达的调节因子。最近，一些研究表明AP2 / ERF，WRKY和MADS也参与了苯丙烷类途径。如图6所示，总共215个bHLH（102个上调和113个下调），245个MYB（124个上调和121个下调），128个WRKY（63个上调和65个下调），47个MADS（23个上调和24个下调）， Var和CK在树皮中差异表达了186种AP2 / ERF（上调90种，下调96种）。此外，在VAR和CK的成对比较中，大多数TF基因在树枝中被下调，而在叶片中被上调。这些不同表达的TF可能会导致肉桂醛，香豆碱和类黄酮产生量的差异。
图6. 在树皮、树枝和叶子的Var和CK之间差异表达的转录因子（TFs）的数量。
结论
在这项研究中进行了代谢物和转录组分析以阐明Var vs CK活性成分差异表达的潜在机制。进行了两个品种之间基因表达和代谢产物水平差异的比较。该分析确定了可能影响肉桂果中肉桂醛，香豆碱和类黄酮生物合成的DEG。肉桂醛和香豆碱含量的差异可能是导致Var与CK精油含量差异的重要因素。结果还表明，光合作用可能对类黄酮的生物合成具有积极作用。该研究为进一步研究精油的调节途径提供了基础。这些发现也可能指导有关决明子虫中苯丙烷和类黄酮生物合成的未来研究。
评论
香精油是肉桂的主要成分。在这项研究中，进行了对肉桂决明子（CK）和肉桂决明子变种之间的转录组和代谢产物谱进行分析。研究确定了Var树枝和叶片中活性成分含量差异的分子机制。结果表明，与CK相比，Var的树皮、树枝和叶片中的类黄酮含量较高，而Var的树皮中肉桂醛和香豆碱的含量较高，但叶片中的黄酮含量较低。转录组分析显示，与CK相比，Var中与光合作用和类黄酮生物合成有关的基因上调。两个品种之间精油含量的差异可归因于与苯丙烷类代谢途径的两个分支有关的基因的差异表达，即一个控制类黄酮代谢并且在Var中高度活跃，而另一个则调节肉桂醛的合成和香豆碱，仅在Var的树皮中上调，而在叶子中下调。这项研究的发现提供了肉桂苯丙烷代谢途径背后的机制的见解。
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