科研 | Plant Physiology: miR159(microRNA)抑制烟草组成型抗病反应
编译：Yong-qin，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：miR159 Represses a Constitutive Pathogen Defense Response in Tobacco
译名：miR159(microRNA)抑制烟草组成型抗病反应
期刊：Plant Physiology
IF：6.305
发表时间：2020.04
通讯作者：Anthony A. Millar
通讯作者单位：澳大利亚国立大学
DOI号：10.1104/pp.19.00786
实验设计
① 转基因株系。在烟草、水稻、拟南芥中构建MIM159（通过靶标模拟使miR159功能降低）、GAMYB（过表达）、mGAMYB（miR159结合位点突变的过表达）。
② 转录分析。RNA样品逆转录后，qPCR定量分析mRNA和microRNA表达。
③ 转录组分析。选择烟草的野生型和MIM159株系进行RNA测序，Tophat比对至参考基因组，Cuffdiff筛选差异表达基因，agriGO进行富集分析。
④ 抗病性验证。离体的烟草叶片（野生型和MIM159株系）接种寄生疫霉菌。
结果
1、烟草中的miR159-GAMYB表达模式
miRNA数据库表明烟草只有一种miR159序列，且与拟南芥完全相同（图1A）。qPCR表明miR159在叶片高表达，而花中低表达（图1B）。NCBI数据库显示烟草中有3个GAMYB家族基因，这3个同源基因均有miR159结合位点（图1A）。基于GAMYB 3’端序列进行逆转录PCR，可检测不受miR159影响的转录表达。结果NtGAMYB1/3在花中的转录丰度高，而NtGAMYB2水平相似（图1B）。
2、MIM159株系转录分析
与野生型（WT）相比，MIM159烟草表现发育迟缓，顶端优势不明显（图2A和B）；叶片小而褶皱，花叶黄化（图2C和D）；花小而苍白，花丝较短（图2E）。同时，MIM159花期较迟，种子重量轻（图2F和G）。
qPCR分析发现，MIM159在花和叶中均可高表达（图3A），致使miR159含量明显下降（图3B），也使得NtGAMYB转录转录水平上升（图3C）（这一引物的扩增片段包括miR159结合位点，且可同时扩增3个同源基因）。这表明MIM159的表达可抑制miR159的产生，使NtGAMYB高表达。研究表明miR319与miR159相似性高，然而MIM159并未抑制其表达，也未影响miR319的靶标TCP4的表达（图3D和E）。
本研究同时构建了GAMYB2和mGAMYB2（可抗miR159结合）过表达体。mGAMYB2的miR159结合位点进行了同义突变（图4A）。结果表明GAMYB2株系未表现发育缺陷，而mGAMYB2表现严重的发育缺陷，且特点和MIM159株系相似（图4B和C），包括发育迟缓、顶端优势减弱、叶片向上卷曲、老叶枯萎黄化、花发育缺陷（图4D-F）。qPCR表明mGAMYB2株系中NtGAMYB2高度表达（图4G）。这表明MIM159烟草的表型与NtGAMYB2的高表达有关。
转录组结果表明，MIM159株系中12418个基因上调，9431个基因下调。筛选差异基因1478个（上调）和2345个（下调）。GO富集分析表明，植物防御反应的基因高度富集，包括真菌/细菌防卫。富集第二位的是细胞程序性死亡，其他富集还有激素响应基因、环境响应基因。2345个下调基因中，基因与细胞周期、细胞形态建成有关，尤其是微管的形成，这些下调基因可能是MIM159发育缺陷的原因。而上调基因中，选择50个最显著的基因进行BLAST比对和注释，其中22个病原响应蛋白（PR），与植株抗病性相关。其他防卫基因PAR-1c（病毒诱导）、SAR8.2（水杨酸诱导的系统获得抗病性）、NBS-LRR（植物免疫性坏死反应）的表达也上调。qPCR验证了PR基因的表达，与野生型相比，PR-1b、PR-2、PR-Q的转录水平提高（图5A），在mGAMYB2中也得到同样结果（图5B），因此GAMYB2可正调控PR基因的表达。
3、MIM159株系的抗病性
用寄生疫霉感染离体的烟叶，结果表明野生型高度感病，接种3-4d后感染部位坏死（图6A），而抗病的NC2326烟草品种没有坏死迹象（图6B），MIM159株系没有表现感染的症状（图6C-E）。统计表明MIM159对寄生疫霉的侵染表现较强的抗性（图6F）。
图6 寄生疫霉的侵染验证MIM159株系的抗病性。
4、水稻中的miR159功能
miRBase数据库表明水稻的Os-miR159有两种亚型，但带相同的成熟序列，与拟南芥的At-miR159仅有1个核苷酸的区别（图7A）。水稻中的3个GAMYB同源基因与miR159高度互补（图7A）。qPCR表明Os-miR159在叶和花中均有表达（图7B），而3种GAMYB基因在叶片中转录水平均显著高于花中（图7B），但miR159的存在抑制其在花和叶中的表达。
水稻的MIM159株系，生长高度低于野生型和空载体（VC）对照植株，表现发育缺陷（图8A-D），花发育不良（图8E），这结果与烟草相似。至于转录水平，MIM159抑制了花和叶中的miR159表达，促进了OsGAMYB和OsGAMYBL1的表达（图9）。这表明，miR159的抑制导致GAMYB的调控解除，这一现象在双子叶植物和单子叶植物均出现。奇怪的是，本研究在水稻和拟南芥的MIM159株系中并未发现PR基因的上调（图10）。
图7 水稻miR159-GAMYB结合序列（A）及在花和叶中的表达模式（B）。
图8 水稻MIM159株系的表型。
图9 水稻MIM159株系的NtGAMYB基因表达（qPCR）。
图10 水稻/拟南芥MIM159株系的PR基因表达（qPCR）。
5、通过拟南芥分析GAMYB通路
本研究在拟南芥转基因mNtGAMYB2、mOsGAMYB、mLaMYB33，进行对比。结果表明，这3种过表达均导致莲座状的发育缺陷（图11A），GAMYB的一个下游标记基因CP1（CYS蛋白酶）显著上调（图11B），这表明即使不同外缘物种的GAMYB蛋白在拟南芥中表达，依旧可以激活类似的通路。但是，PR基因的转录水平在mGAMYB株系中并无显著上调（图11B）。因此，GAMYB基因似乎只在烟草上可以上调PR基因的表达。
图11 拟南芥mGAMYB株系的表型和PR基因表达。
讨论
尽管miR159-GAMYB调控关系发现已很久，但这一互作的在植物生长发育中的具体作用仍不明确。在所有物种中，miR159都高度抑制GAMYB在营养组织的表达，miR159的抑制会导致烟草、水稻、拟南芥的GAMYB基因失调，对生长发育有害，转录水平上细胞周期、细胞形态建成的相关基因都下调，这些表型和基因表达差异都和GAMYB基因的上调有关。目前出现唯一结论不同的物种是大岩桐，miR159的抑制不会危害其生长，反而加速开花。因此，GAMYB对植物生长发育的影响在物种中广泛存在，仅有个别例外。
在MIM159株系的烟草中，组成型防御基因（PR、PAR-1、Sar-8.2、NBS-LRR）均显著上调，且对病原菌（寄生疫霉）表现出强的抗病性，先前的研究也有表明PR、Sar-8.2基因与寄生疫霉的抗性相关。这间接表明miR159抑制触发了植物植物的防御反应。但GAMYB基因的上调与PR基因的关系仍有待进一步研究。
基于本研究的结论，我们假设GAMYB在营养组织一直有转录本，但一直受miR159抑制（图12）。而当有病原菌感染时，miR159的抑制作用使GAMYB活性增强，触发植物防卫反应和过敏性细胞坏死，尽管GAMYB对植物发育有潜在危害。此外，我们推测MIM159株系的叶片褪绿可能是过敏性反应的结果。目前没有明确的证据表明miR159或GAMYB表达与植物应激反应的关系，但可以确定miR159在翻译水平调控GAMYB的表达，因此生物应激反应可能通过调控miR159的转录，使得GAMYB的翻译水平发生变化，而转录水平不变，比如疫霉编码的沉默子可能会抑制miR159的转录。此外，GAMYB可通过破坏其保守的二级结构从而加强表达，因为这些二级结构是miR159结合的必需要素。
为了深入了解烟草中miR159-GAMYB在防御反应的潜在作用，未来的研究应探究能抑制miR159表达的病原及其因子，先前研究表明疫霉能抑制番茄番茄的miR159表达并促进MYB基因表达，强化番茄的抗疫病作用，但是当番茄感染了卷叶病毒，miR159水平却上升，MYB基因水平下降，这不利于病原体的抵抗。另一个问题是GAMYB介导的植物防御反应是否只特异存在于烟草，或者其他茄科植物也存在，这一研究将有利于更好地理解miR159-GAMYB通路。
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