综述 | Cancers：MicroRNA和其他非编码RNA在癌症恶病质中的新兴作用
编译：小北，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：The Emerging Role of MicroRNAs and Other Non-Coding RNAs in Cancer Cachexia
译名：MicroRNA和其他非编码RNA在癌症恶病质中的新兴作用
期刊：Cancers
影响因子：6.162
发表时间：2020年4月19日
作者：Rui Medeiros
单位：葡萄牙CI-IPOP研究中心
DOI：10.3390/cancers12041004
主要内容
1 前言
癌性恶病质是骨骼肌大量减少，有或没有脂肪缺失导致进程性功能损伤，并且通过传统的营养供给不能逆转。这一综合征是导致严重的疲劳、降低抗肿瘤的治疗效果，使生活质量降低并且提高了发病率和死亡率。常用的化疗导致更严重的癌性恶病质。
癌性恶病质具有一些关键的特征例如肿瘤和免疫细胞释放的促恶病质细胞因子、骨骼和心肌肌肉的消瘦和萎缩、能量平衡的改变、中枢神经系统内稳态的控制以及脂肪组织消耗。近期的一些研究旨在确定参与癌性恶病质的分子机制，特别是与肌肉相关的。确定和区分导致癌性恶病质的分子通路有助于更好的理解病理过程、确定疾病治疗的靶向和生物标记物。
癌性恶病质影响了50%-80%的肿瘤患者并且导致高达20%的癌症死亡。但是目前对癌性恶病质的规定并不统一，尽管已经有国际的共识定义了诊断的规则。无论是哪个规则都明确的指出肿瘤与癌性恶病质更相关，且不同类型肿瘤患者癌性恶病质的发生和程度是变化的。例如85%的胰腺癌患者出现极消瘦的现象而15%并没有，这可能由肿瘤表型突变或者基因表型导致的。因此，预测哪个患者会发展成为癌性恶病质是困难的。此外，癌性恶病质由三个不同的阶段：消瘦前期、消瘦期和顽固性恶病质。顽固性恶病质通常由医生诊断，癌性恶病质的早期诊断是不存在的，此阶段的干预通常无效。因此需要在综合征的早期进行干预。急需癌性恶病质的生物标记物来早期确定哪些患者最易遭受癌性恶病质。然而目前的发现并未转入临床应用，已经提出的一些生物标记物是蛋白和具有标记物潜能的检测蛋白由于复合体结构及其准确测定的方法或者新抗体的生产需要耗费时间并且价格昂贵。另一方面，核苷酸标记物（例如microRNAs）需要较少的时间和更低的花费，现如今技术的应用也使核苷酸的检测更加容易。
目前最有效治疗癌性恶病质的方法是治愈癌症。不幸的是，肿瘤类型与癌性恶病质密切相关。另一方面实验数据表明即使面临肿瘤细胞持续生长，靶向敲除促癌性恶病质的信号通路能够延长存活时间。癌性恶病质增加了治疗的困难和细胞毒性、更易被感染、造成疲劳、增加了住院时间。因此治疗癌性恶病质对于提高病人的存活时间和生活质量是非常重要的。一些治疗干预已经进入测试，但是这一症状的治疗选择仍然非常少并且受限。部分原因可能是大多数临床试验病人大多是顽固性癌性恶病质阶段，此外癌性恶病质是一个多因素的综合征，多模式的治疗可能对治疗该病更加有效。
近些年，非编码RNAs（ncRNAs）例如microRNAs参与调节癌性恶病质病理形成信号通路的调节。一些miRs的异常表达在癌性恶病质的小鼠和患者中均有发现，这也提示它们可与不同特征的癌性恶病质相互作用并且作为潜在的生物标记物或者治疗靶向应用。本综述旨在总结近些年miRs和其他ncRNAs在癌性恶病质中的数据并且讨论它们潜在的应用。
2肌肉萎缩中的microRNAs
在动物模型和人类的体外研究发现miRs在癌症癌性恶病质中参与肌肉萎缩（图1、图2、表1）。有研究表明肺和胰腺癌的微泡过表达miR-21能够引起骨骼肌细胞的凋亡。在TLR7缺失的小鼠原发性成肌细胞与Lewis肺癌细胞共孵育发现细胞死亡显著降低。当与癌性恶病质胰腺癌患者血清中的微泡共孵育，细胞受保护同样观察到死亡降低。此外miR-21外加能够提高TLR7+/+成肌细胞的死亡。有趣的是在微泡或者miR-21存在的条件下，抑制JNK和p38能够有效的降低成肌细胞的凋亡。暴露在微泡和miR-21下，JNK和c-JUN能够瞬时引起成肌细胞的增殖，但是p38的活性并未受到改变。因此研究提示含有miR-21的微泡能够通过激活TLR7信号通路与JNK的下游，促进成肌细胞的死亡。
表1 参与肌肉萎缩的miRNAs
Parp-1和Parp-2缺失的肺癌癌性恶病质的小鼠中发现miR-1在骨骼肌中表达降低。miR-133a在野生型和Parp-2的癌性恶病质小鼠的隔膜和腓肠肌中下调。在Parp-1缺失的动物中miR-133a仅在隔膜中下调。MiR-206在Parp-1和Parp-2缺失小鼠的隔膜中表达水平降低，在野生型小鼠中两者在隔膜和腓肠肌中均有下调。在野生型和Parp-2癌性恶病质小鼠的隔膜和腓肠肌中miR-486表达降低。然而在Parp-1缺失的癌性恶病质小鼠中，miR-486在任何肌肉中均无差异。因此这些miRs在野生型癌性恶病质小鼠的隔膜和腓肠肌中表达降低。在肺癌癌性恶病质小鼠的腓肠肌中能够通过miR-133a、miR-206和miR-486抑制Parp-1能够促进肌肉的增殖和分化，然而Parp-2通过miR-206抑制能够促进肌肉的分化。此外，在Parp-1缺失的小鼠隔膜中miR-486表达，而在Parp-2缺失的小鼠中并未观察到miRs的显著表达。总之，这项研究提示在肺癌癌性恶病质中抑制Parp-1而不是Parp-2更易表达肌肉相关的miRs。重要的是，隔膜和腓肠肌中的不同结果说明miRs参与癌性恶病质相关信号通路的位点差异表达。
图1 在小鼠癌性恶病质模型中肌肉和脂肪组织萎缩与ncRNAs的异常调节
在Lewis肺癌癌性恶病质的小鼠中，选用胫前肌作microRNA测序。9个miRNAs被发现差异表达，特别是miR-147-3p、miR-299a-3p、miR-1933-3p、miR-511-3p、miR-3473d、miR-223-3p、miR-431-5p、miR-665-3p、miR-205-3p，这些miRNAs参与多个生物学过程，包括细胞与细胞之间的信号通路、细胞发育、细胞生长和炎症反应。
利用二代测序技术在癌性恶病质和非癌性恶病质的胰腺癌和大肠癌骨骼肌组织中进行miRs图谱绘制，8个miRs分别是miR-3184-3p、miR-423-5p、let-7d-3p、miR-1296-5p、miR-345-5p、miR-532-5p、miR-423-3p、miR-199a-3p在癌性恶病质中上调。qRT-PCR 实验证实miR-3184-3p、let-7d-3p、miR-1296-5p，并且191 个mRNA的靶基因被确定。这些靶基因在脂肪生成、脂生成、信号转导以及炎症和先天性免疫反应中发挥重要作用。此外，被确定的miRs表现出诊断和预测的价值。
在非小细胞肺癌晚期的患者股中间肌中有28个差异表达的miRs被确定。排名最高的miRs发现在癌性恶病质患者的肌肉中miR-424-5p、miR-424-3p、miR-450a表达显著上调，miR-451a、miR-144-5p下调。为了区分非小细胞肺癌病人和健康的群体，随机分选函数利用miR的表达作为癌性恶病质的预测指标发现AUC = 0.5显著不同；miR-424-3p和miR-450a-5p结合获得AUC = 0.79，miR-144-5p提高AUC 到0.85。利用miRTarBase确定了158个基因作为miRs的靶向并且再现了包括白介素6、TGF-β、TNF-α、PI3K-Akt等信号通路。有趣的是在体内多个肌肉萎缩模型中观察到miR-129b上调，提示其在多个刺激应答中通过靶向Igf-1和p85驱动骨骼肌肌肉萎缩。
除了癌症多个疾病也与癌性恶病质相关，关于miRs和肌肉萎缩的研究已有发表。
在鼠心肌肥大的研究中发现miR-29b-3p、miR-132-3p、miR-27a-5p、miR-337-5p、miR-434-3p、miR-539-5p、miR-136-5p、miR-210-5p、miR-322-3p、miR-331-3p、miR-376c-3p、miR-29a-3p、miR-204-5p、miR-30d-3p、miR-146b-5p、miR-632、miR-214-3p、miR-489-3p差异表达。MiR和mRNA表达的联合分析图谱发现这些miRs参与蛋白降解、ECM组织、呼吸电子传递以及三羧酸循环等信号通路。有趣的是miR-29a-3p和miR-29b-3p有一些共同的靶向mRNAs，例如编码ECM相关的蛋白，体外研究发现取自C2C12的肌管细胞转染miR-29b模拟物能够显著降低肌细胞的区域、总蛋白的浓度、肌管的数量，Myh7、Myh2、Col1a1、 Col3a1的转录水平。
链脲霉素诱导的小鼠代谢模型中用于调查代谢相关的癌性恶病质中miRs的作用。在胫前肌中注射过表达腺体相关的病毒miR-23a~27a~24-2的前体RNA，将导致miR-23a、miR-27a和磷酸化的Akt升高，FoxO1、Pten、Trim63、Fbxo32的转录水平降低，肌肉生长抑制素的mRNA和蛋白水平、SMAD2/3的磷酸化。
此外miR-23a和miR-27a的上调能够减弱饮食诱导的肌肉横截面积减少 并且补救肌肉的功能。奇怪的是，这些小鼠的肾纤维化降低，同时伴随肾脏中Smad2/3磷酸化、α-平滑肌肌动蛋白、纤维连接蛋白和胶原蛋白水平降低。此外miR-23a和miR-27a的水平在血清外泌体和肾脏中升高。因此肌肉中过表达miR-23a/27a能够阻止饮食诱导的肌肉癌性恶病质，并且减弱肾脏纤维化损伤，这也提示肌肉-肾脏之间相互交流。
体外研究数据发现miR-424-5p靶向编码与蛋白合成相关蛋白的mRNAs，是rRNA转录的Pol I RNA前期起始复合体所必需的。在小鼠中miR-424-5p的表达将导致肌肉萎缩并且降低rRNA的水平。在慢性阻塞性肺病患者中miR-424-5p升高将与疾病的严重性和肌肉大量消减有关。外科手术前骨骼肌中miR-424-5p的表达与主动脉手术7天后肌肉减少相关。
总之这些数据都提示miR是在调节骨骼肌肌肉生长信号通路中发挥重要作用。一些miRs例如miR-29b似乎能够在,肌肉萎缩中枢协调信号通路网络并且作为治疗的潜在生物标记物有待深入研究。
3 microRNAs与脂肪组织消耗
除了骨骼肌肌肉萎缩，白脂肪组织的脂解和褐变同样是癌性恶病质的重要特征。Wu等人的体外研究发现乳腺癌4T1细胞分离的外泌体可能通过miR-155引起癌性恶病质。将脂肪细胞与乳腺4T1细胞共孵育发现参与脂肪积累UCP1的表达升高并且PPARG和(P)-PPARG 的表达降低。ERK1/2同样降低而P-p38升高。此外成熟的肌细胞与乳腺癌细胞共孵育会导致细胞死亡、肌凝蛋白重链1缺失、肌管萎缩、UCP3的水平升高、P-p38过表达同时P-ERK1/2、PPARG、P-PPARG下调。这些研究都支持假说：miRs在肿瘤外泌体中促进脂肪细胞和肌纤维分解代谢。miR-155在4T1外泌体中上调并且在脂肪细胞中靶向PPARG褐变兵器重塑脂肪代谢。有趣的是肿瘤细胞与脂肪细胞或者肌细胞共培养促进侵袭。
表2 脂肪组织消耗中的miRs
与这些结果一致的是，将慢性粒细胞性白血病细胞K562分离得到的外泌体注入小鼠发现体重和身体的脂肪明显降低。通过RNA测序发现miR-92a-3p在K562细胞和外泌体中均上调。此外，脂肪驱动的间质干细胞能够吸收K562的外泌体，反之抑制脂肪形成的能力。特别是外泌体中的miR-92a-3p能够通过降低Cebp的表达抑制脂肪形成的能力。在胃肠道癌癌性恶病质腹部皮下脂肪组织中发现miR-483-5p、miR-23a、miR-744、miR-99b下调而miR-378显著升高。此外，miR-378的表达与儿茶酚胺刺激脂解作用高度正相关。在体外多个捐赠者中获取的人类原代脂肪细胞中转染miR-378抑制剂将负调控去甲肾上腺素引起的脂解作用以及对LIPE、PNPLA2、PLIN1的下调。
总之这些研究证实肿瘤衍生的miRs对脂肪降解发挥作用（表2）。未来可以定量外周血中的这些miRs，开发成潜在的生物标记物。
4 microRNAs与恶病质-体内平衡控制
下丘脑是控制能量稳态和食物摄入中非常重要，包括炎症生长因子在内的多个调节因子在下丘脑区域调控生命活动。在癌性恶病质中，下丘脑调节能量消耗增加并且食欲降低。有研究表明miRs如何调节下丘脑的功能并且影响癌性恶病质的病理形成。研究者评估了厌食小鼠下丘脑和脑皮层的转录组，同时开发了食欲不振-癌性恶病质综合征。在厌食小鼠的下丘脑中大多数检测的miRs更易上调，而在脑皮层样品中预测miRs靶向的mRNA更易下调。在下丘脑中确定miRISC复合体相关基因上调，也就是Dgcr8、Fmr1、Ago2、Ddx6、Pabpc1，这也提示在厌食小鼠下丘脑中可改变的miR的机制并且通过下丘脑的改变导致癌性恶病质。然而，下丘脑中miR改变促进厌食小鼠表型的准确机制有待进一步确定并且通过额外的研究中验证。此外关于miRs在内稳态控制中的角色应该继续探究。
5 循环中的microRNAs
除了miRs的细胞内定位，在细胞外环境和生物流体例如血浆和血清。在这些流体中循环中的miRs存在于RNA-蛋白复合体或者包裹在细胞外血管中防止降解。越来越多的证据表明循环中的miRs作为细胞间信号调节中间物。重要的是循环中的miRs在多个疾病临床中具有生物标记物的潜能。
循环中的miRs对于早期癌性恶病质的检测和癌症患者发育的监测非常有用。对头颈癌患者的研究定量了血浆中miR-130a的表达并且发现低表达的miR-130a患者血浆中具有更高TNF-α浓度和划分为癌性恶病质的风险。此外，低表达的miR-130a能够区分中度的或者轻度营养不良的癌性恶病质患者(79.4%敏感性和80.8%特异性; AUC = 0.865 (0.759–0.936))。伴随血浆中高水平的TNF-α，癌性恶病质MiR-130a的检测发现83.3%的敏感性和91.7%的特异性(AUC = 0.931 (0.794–0.988))。当身体的体重降低超过5%时，应用SGA发现miR-130a提高了营养评估(88.6%敏感性、94.3%特异性、93.9%阳性预测值以及89.2%的阴性预测值。这些结果提示miR-130a在头颈癌化疗患者中可作为预测癌性恶病质的生物标记物。此外，miR-130a能够提高癌性恶病质诊断中SGA的准确性。
另一项研究评估了结肠直肠患者血清中miR-203的表达并且发现低腰肌质量指数PMI低的患者中miR-203高表达。肌内脂肪组织含量与组织或者血清中miR-203的表达无关。血清中高表达的miR-203可作为检测肌细胞减少的独立指标。研究者发现血清中的miR-203的表达可作为结肠直肠癌患者肌细胞减少的生物标记物。体外实验也发现在人类骨骼肌细胞中转染miR-203模拟物能够抑制细胞增殖、提高凋亡率并且存活细胞的数目显著降低。凋亡的抑制因子BIRC5被确定是miR-203的靶基因。
在慢性阻塞性肺病血浆中miR-422a的水平与肌肉萎缩相关。血浆中miR-422a的水平与肌肉强度负相关，并且在肌肉中高表达。体外研究发现在肌细胞中miR-422a能抑制SMAD4的表达并且抑制TGF-β信号通路。这些体外的结果提示miR可在肌细胞中抵抗分解代谢。
6 在癌性恶病质中的其他非编码RNAs
6.1 lncRNAs
长链非编码RNAs（lncRNAs）是长度超过200个核苷酸的RNA，不能编码蛋白。与其他非编码RNAs相比，这组RNA包含不同大小、形状和功能。LncRNAs在调节和重塑染色质结构、转录调剂、调节核体、mRNA的转换和翻译以及干扰翻译后修饰等发挥多个作用。LncRNAs能够通过多个通路影响mRNA转换，例如作为miR海绵降低他们的调节作用。越来越多的证据发现lncRNAs能够作为许多疾病的调节因子，例如癌症和癌性恶病质等。然而，lncRNAs在癌症恶病质中的作用和机制少有报道（图1，2）。
6.1.1 肌肉萎缩中的lncRNAs
肌细胞生成扰乱与癌性恶病质相关，LncMyoD在成肌细胞分化过程中被MyoD直接激活，一旦活化，LncMyoD与IMP2结合能够负调控IMP2调节N-Ras、 c-Myc等关键基因的转录。Gong等人的研究表明敲除lncRNA由于不能退出细胞周期能够抑制肌细胞的分化。因此LncMyoD可作为癌性恶病质相关lncRNA的潜在lncRNA。
图2 在癌性恶病质的肌肉和脂肪组织中循环的ncRNAs和异常调节的ncRNAs
lncRNA MAR1是最新发现，与肌细胞分化和再生相关的lncRNA。这一lncRNA在小鼠骨骼肌中高表达并且同肌细胞分化和生长正相关。lncRNA MAR1吸纳miR-487b，能够调节Wnt5a促进肌细胞的分化和再生。MAR1的过表达能够减弱肌肉萎缩，维持肌肉的量和强度。因此MAR1被认为是治疗与癌性恶病质相关肌肉萎缩的新靶向。
LncIRS1是另一个被确定在小鼠骨骼肌中富集的lncRNA，与内源性RNA竞争发挥作用。这项研究表明lncIRS1能够调节成肌细胞的增殖和分化并且调节肌肉的量和肌纤维横截面积。IGF1-PI3K/Akt信号通路能够控制蛋白的合成和降解，并且敲除IRS能够降低IGF1，导致小鼠体重的降低。LncIRS1作为miR-15家族的海绵能够调节IRS1的表达，且它的过表达能够激活IGF1-PI3K/Akt信号通路，促进IGF-1的表达、激活AKT的磷酸化。因此lncRNA在促进骨骼肌细胞增殖分化、提高肌细胞的量以及对抗肌肉萎缩中发挥重要作用。
Sun等人确定了lncRNA Atrolnc-1在小鼠慢性肾病癌性恶病质的萎缩肌肉中显著升高。Atrolnc-1能够促进NF-ΚB的活化并且提高Trim63的转录，这将踧踖蛋白的降解和肌肉萎缩。抑制Atrolnc-1能够通过抑制Trim63的表达改进肌肉萎缩，研究者推测lncRNA通过活化NF-ΚB在恶病质起始中扮演重要角色。LncRNAs在肌肉萎缩中发挥重要作用。然而尚未有癌症相关癌性恶病质模型的报道。这一领域的研究将获益于额外的癌性恶病质模型。
6.1.2 lncRNAs与脂肪组织消耗
2018刘等人分析了胃肠癌患者中癌性恶病质有或者无患者的脂肪组织发现, VLDLR-AS1的下调与癌性恶病质和脂肪组织缺失相关。研究者预测VLDLR-AS1能够通过与miR-600和GOLGA3相互作用调节GOLGA3、DUSP14、UCHL1相互作用，通过与miR-1224-3p相互作用调节ZNF219、RNF141、CALU。在脂肪组织生物学中一些重要的lncRNAs在癌性恶病质小鼠注射C26细胞后被确定。敲除CAAlnc1能够促进脂肪生成，CAAlnc1在肝脏中富集并且在灰质比白色脂肪组织更加丰富。研究者提示CAAlnc1通过与HuRt相互作用抑制脂肪生成，导致脂肪组织的缺失。
6.2 环形RNAs（circRNAs）
circRNAs是一组特异外显子环化产生的RNA，通过共价结合外显子的3’端至上游外显子的5’端。尽管有报道称某些circRNAs能够编码蛋白，circRNAs被分类为非编码RNAs。有报道称circRNAs具有多个miR结合的位点可作为miR的海绵，有报道称circRNAs在人类疾病的发育过程中发挥重要作用，但是在癌性恶病质中的角色鲜有报道。
CircRNAs与脂肪组织消耗：有一篇报道阐述了circRNA在癌性恶病质中的角色，发现胃癌患者外显子中circRNA Hsa_circ_0010522 (ciRS-133)高表达。且circRNA的表达水平在肿瘤中高于邻近组织。此外，ciRS-133的表达与脂肪灰质的量和身体肥胖比率正相关。体外研究也表明miR-133与ciRS-133直接相关。此外SGC7091的外显子中ciRS-133的表达较高，当加入3T3L1细胞的培养基时PRDM16和UCP1上调。过表达miR-133能够抑制PRDM16和UCP1，然而敲低miR-133能够提高PRDM16和UCP1的水平。SGC7091的外显子能够加速葡萄糖消耗率、更高的耗氧量并且提高最大呼吸量。在小鼠中注射过表达ciRS-133的SGC7901细胞发现，在肿瘤组织、血清外泌体以及腹股沟脂肪组织中ciRS-133的表达显著上调。这些小鼠腹股沟脂肪组织变成褐色并重量减轻。这些发现提示ciRS-133可能通过脂肪组织褐变加重了癌性恶病质，并且circRNA可作为治疗的潜在靶向。
7 总结
癌性恶病质由肿瘤或这宿主对肿瘤出现免疫反应释放的多个因素导致。近期，已经确定这些因素是miRs和其他的ncRNAs，并且它们在癌性恶病质的病理形成过程中扮演的角色越来越多的被识别。
近期的研究确定了miRs、lncRNAs、circRNAs等的功能主要子肌肉和脂肪组织萎缩，值得强调的是动物模型是研究ncRNAs在萎缩方面发挥作用的重要工具。由于从病人的肌肉或者脂肪组织活检的程序是侵入性的，这是难以获取的。此外动物模型是检测miRs和其他ncRNAs的潜在工具。然而，在动物模型中用于诊断癌性恶病质的准则尚不明确，值得在未来研究中深入探讨。全身免疫反应是癌性恶病质的驱动因素，炎症调节因子诱导能够引起肌肉/脂肪组织萎缩的信号通路并且导致代谢失调以及食欲减退相关信号通路的活化。像NcRNAs Atrolnc-1能够引起NF-KB活化，在癌性恶病质中发挥主要作用。在癌性恶病质中ncRNAs和促炎症信号通路之间的相互调节有待进一步探究。此外循环中的miRs作为生物标记物的研究仍然是不足，这可能是一个前景的领域以提高癌性恶病质患者早期诊断和准确监测。由于体重降低是癌性恶病质的一个重要特征。调节体重降低的ncRNA与癌性恶病质之间的关系有待进一步探究。
有关lncRNAs和circRNAs在癌性恶病质中的研究仍然欠缺，目前的研究仍然聚焦在miRs，总体而言，在癌性恶病质中ncRNAs发挥的生物学功能仍需探讨，也需要有研究划分它们在临床应用中潜在的作用。
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