科研│ 哈佛大学医学院：单细胞测序和遗传记录揭示了胚胎发育过程中的谱系决策
编译：不二，编辑：景行、江舜尧。
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早期发育可以通过将胚胎干细胞（ESC）分化为三个胚层异质混合物的胚状体（EB）来模拟。研究人员结合单细胞转录组学和遗传记录来研究EB的分化，绘制了一个时间过程的转录状态图，并模拟了细胞向不同胚层发育时的细胞命运轨迹和分支点。为了验证这个模型，研究人员提出了一种创新的诱导基因记录技术，它利用重组在一个时间段内产生细胞特异的时间邮戳条形码。研究人员验证了轨迹结构和关键分支点，包括植入前外胚层样细胞来源的原始胚层样细胞（PGC）谱系的早期规范。研究人员进一步确定了DNA甲基化在PGC外胚层决策中的一个暂时性作用。研究为胚胎发生的类器官模型提供了一个高分辨率的细胞谱系图谱，深入了解细胞命运规范的表观遗传决定因素，以及快速分化过程的谱系决策。
论文ID
原名：Parallel Single-Cell RNA-Seq and Genetic Recording Reveals Lineage Decisions in Developing Embryoid Bodies
译名：单细胞测序和遗传记录揭示了胚胎发育过程中的谱系决策
期刊：Cell Reports
IF：8.109
发表时间：2020年10月
通讯作者：Bradley E. Bernstein
通讯作者单位：哈佛大学医学院附属麻省总医院
DOI号：10.1016/j.celrep.2020.108222
实验设计
结果
1 单细胞测序与发育轨迹的重建
研究人员将小鼠ESC细胞培养在添加血清和白血病抑制因子（LIF）的培养基中，并将每孔约1000个细胞接种到没有LIF的相同培养基中以成熟分化。在没有LIF的情况下，培养物自发聚集并在14天内分化成EB细胞（图1A）。血清中的ESC加LIF相当于第0天。在第1天，细胞聚集体开始形成，到第2天，出现具有可见亚结构的致密聚集体。在第14天，EB表达所有三个胚层的标记基因：中胚层（MES）、内胚层（EN）和外胚层（ECT）。
为了在单细胞分辨率下表征EB的转录组，研究人员连续14天每隔48小时分离活细胞，并使用CEL-seq2进行深度转录组分析。这种基于平板的方法相比基于液滴的单细胞技术通量较低，但每个细胞获得的转录本数量显著增加，增强了区分细胞状态的能力。根据单个细胞的细胞条形码将RNA测序数据分配给它们，并使用唯一分子标识符（UMI）计数单个mRNA分子。研究人员从1536个细胞中获得了高质量的数据，这些细胞通过了质量控制（QC）和基因复杂性指标。总的来说，大约80%的细胞通过了QC。对于通过QC的细胞，研究人员检测到平均每个细胞约6000个基因，UMI的中位数为44197个。
接下来，研究人员利用单细胞转录组学数据推断EB时间过程中的分化轨迹。Monocle 2是一种基于图形的机器学习方法，它根据单细胞转录组的相似性对其进行排序，并给出了一个“拟时间过程”的图形（图1B）。Monocle 2假设不同的轨迹可以用一个具有不同状态的树结构来描述，并且每个细胞的拟时间值是一个单元必须从该树中用户指定的根状态移动的距离。因此，这种拟时间过程可以被认为是通过生物过程进展的定量度量（图1C）。重建的轨迹包括26个细胞簇状态和6个不同的末端分支。然后，研究人员通过差异基因表达分析和层次聚类（图1B、1D、1E）将这26个细胞簇合并成10个主要细胞群。轨迹中时间的增加、分化的增加和细胞多能性的降低相关。
细胞表达早期胚胎细胞经典的标记物（图1B、1D和1E）；例如，ESC细胞的Oct4、Nanog、Gbx2、Klf4和Dppa2；原条（PS）样细胞的T、Fgf8和Wnt3；以及胚层的经典标记物。研究人员基于PrE标记物（Foxq1、Cubn和Srgn）和EN标记物（Spink1、Afp和Dab2）鉴定了胚外原始EN（PrE）样细胞和EN样细胞（图1D、1E）。还鉴定了两个外胚层样细胞簇：植入前的外胚层样细胞在第2-4天出现，表达Aire、Pfkp和Gstm1；植入后的外胚层样细胞在第6天出现，表达Fgf5、Pou3f1和Dnmt3b（图1B和1D）。最后，对一小群表达Cdh5、Tie1、Tal1和Fli1的血祖细胞样细胞进行了注释（图1B和1E）。所有10种细胞状态在两个独立的生物重复中都得到了鉴定。此外，所有主要细胞谱系都存在于所分析的每个EB中。
图1. 单细胞分析与发育轨迹的重建。（A） 概述了实验设计和胚胎发生的相应阶段。（B） 来自EB时间过程所有阶段的1536个单细胞转录组的拟时间轨迹。（C） 来自（B）的拟时间轨迹，每个实时点的细胞以红色叠加。（D和E）热图显示基于相同1536个单细胞转录组差异表达基因的聚类。
2 PGC样细胞的注释
因为Monocle 2图通过转录组的相似性对单个细胞进行排序，所以它给每个细胞分配一个拟时间分数，反映其与ESC状态的差异。单个细胞的拟时间分数与收集的实际时间点有很好的相关性，但有一些明显的例外（图2A）。特别是，研究人员鉴定了36个植入前的外胚层样细胞，尽管在EB分化的多个时间点检测到，但拟时间分数较低。这表明这些细胞在分化过程中受到阻滞（图2A）。
这些细胞映射到ESC细胞、植入前外胚层样细胞和植入后外胚层样细胞之间分支点的轨迹（图2B）。该细胞簇中最显著的差异表达基因是先前报道的PGC标记，如Dppa3/stella、Ifitm1和Tfap2c（及其同源基因Ap3b2），或生殖分化细胞标记，如Tex14/15、Tdrd12和Ooep（图2C）。无偏聚类将这36个细胞与其余的着床前外胚层样细胞分离，表明它们代表不同群体。因此，研究人员将该细胞簇注释为PGC样细胞（图2D）。
3 EB分化再现了原肠胚形成前胚胎的发育轨迹
接下来，研究人员比较了EB分化过程中发现的主要群体与原肠胚形成前小鼠胚胎的转录组。将指定的细胞谱系先前的RNA测序图谱与体细胞和单细胞研究中注释的体内细胞群体相关联（图2E）。总的来说，来自EB的主要细胞簇表达谱与注释的体内细胞类型相关性良好（R>0.5）。此外，与体内胚胎的单细胞数据比较表明，研究人员称之为EN的细胞群是确定性的EN（DE）和胚外内脏EN（VE）的混合物。ESC、外胚层样细胞、PS和三个胚层的存在，以及与已发表的体内数据集的一致性，表明研究人员的EB时间过程大致概括了小鼠胚胎发生阶段E3.5-E7.5的主要细胞类型，早期胚层分化与植入前囊胚相对应（图1A）。
研究人员还试图确定PGC样细胞与体内PGC的相似程度。PGC是一种特异的单能细胞状态，在体内由E6.5成熟的、植入后的外胚层细胞产生，以响应来自胚外组织的BMP4信号。添加BMP4和其他外源性信号因子可增强EB和其他体外模型中PGC的形成。尽管BMP4信号传导的下游基因，如Blimp1/Prdm1和Prdm14，在体外PGC样细胞中表达，但在差异基因表达分析中，它们没有达到统计学意义。接下来，研究人员将EB来源的PGC样细胞与不同阶段分离的胚胎组织进行比较，这表明EB来源的PGC样细胞与E4.5着床前外胚层细胞和从E11.5胚胎分离的PGC细胞共享转录过程（图2F）。PGC样细胞也似乎循环缓慢，但研究人员没有发现证据表明它们在EB时间过程中发育为成熟生殖细胞，可能是因为该类器官系统中缺乏其他外源性因素。
综上所述，实时和拟实时信息显示，主要细胞谱系在EB中自发产生，其严格的时间顺序与发育中的胚胎相同（图1A、1C和2E）。
图2. EB分化再现了原肠胚形成前胚胎的发育轨迹。（A） 图1中1536个单细胞的实时采集点（y轴）与拟时间分数（x轴）的比较图。（B） 拟时间轨迹如图1B所示，带有分化停滞细胞的放大图（橙色圆点，黑色轮廓）。这些细胞落在ESC（红色）、Epib前细胞（橙色）和Epib后细胞（灰绿色）的分支点。（C） 显示分化停滞的细胞群中差异表达基因。（D） 热图显示了基于前30个差异表达基因的聚类，这些差异表达基因来自注释为PGC样（黄色）或Pre-Epib（橙色）的细胞的单细胞转录组。（E） 热图显示了带注释的EB细胞状态与体内分离群体的RNA测序的基因表达数据的相关性分析
4 分化轨迹的转录动力学
Monocle 2产生的单细胞图暗示了至少六个分支点，其中一个分叉成两个交替的分支。为了发现这些细胞命运决定的调节基因，研究人员研究了轨迹分支点附近每个细胞群的基因表达动态。第一个分支是ESC细胞分离成PrE或植入前的外胚层样细胞。这发生在时间进程的第0天和第4天之间（图3A）。这种分支近似于内细胞团（ICM），在E4.5分离为前胚层和外胚层。研究人员使用差异表达基因的层次聚类来定义分支特异性转录模块和基因表达模式。最靠近分支点的PrE细胞由基因表达模块定义，该模块包括Gata6和Pdgfra的表达，而第二个基因模块包括Col4a1、Cubn和Srgn，随着沿着该分支的分化而上调（图3B、3C）。相反，着床前外胚层样细胞群是由Otx2和Aire表达决定的，随着细胞沿着这个分支分化而增加。这种分支发生在经典外胚层标记基因（如Dnmt3b和Fgf5）在时间进程中表达之前（图3E和3F）。
第二个分支涉及到植入前外胚层样细胞向PGC样细胞或植入后外胚层样细胞系的分化。这发生在时间进程的第4天到第6天之间（图3D）。植入后外胚层样细胞的存在表明这种分叉接近于植入后期。在轨迹中，沿着PGC样分支分化的细胞获得PGC标记基因（Dppa3/stella、Ifitm1和Tdrd12）和去甲基化基因（例如Tet1和Tet2）的表达。相反，沿着植入后外胚层样分支分化的细胞高表达外胚层标记基因（Pou3f1/Oct6和Fgf5）（图3E、3F）。这些经典的外胚层标记的表达严格限制在第6天的时间点。沿着植入后外胚层分支细胞的DNA甲基转移酶也上调，与体内该细胞谱系中DNA甲基化的增加一致。随着细胞沿着着床后的外胚层分支拟时间继续，它们开始表达PS标记基因（Wnt3a和Fgf8），并且外胚层标记基因的表达急剧降低（图3E、3F）。
植入导致外胚层细胞从原始到成熟的多能性发生转变。研究人员通过这3个基因模块的表达，比较了总体、原始到成熟的多能性基因模块和第0-6天的聚集细胞（图3G）。观察到EB中植入前和植入后外胚层样细胞之间的多能性状态有类似的转换（图3G）。在EB中，植入前的外胚层样细胞表达原始的和总体的多能性基因模块。相反，植入后的外胚层样细胞表达成熟的和总体的多能性基因模块（图3G），所有多能性因子的表达随着沿着植入后的外胚层分支向PS样细胞的拟时间增加而急剧减少（图3E和3F）。在体内，PGC起源于E6.5的植入后外胚层，随后获得原始多能干细胞状态。在EB中，PGC样细胞似乎维持其原始状态，并来源于原始的植入前外胚层样细胞群（图3G）。
基于图形轨迹下一步映射植入后外胚层样细胞的进展成为PS和随后的分支点，指定交替的胚层和BP。时间轨迹和顺序与胚层发育的已知特征基本一致。此外，这些后期分支点的标记基因表达与体内所见非常相似。简单地说，随着细胞在拟时间内沿着轨迹前进，PS细胞首先分支形成EN并表达典型的EN标记，如Foxa2、Gata4和Dpp4。接下来，轨迹分叉形成S.Ect（表面外胚层），细胞表达经典的表面外胚层标记，如Sox11、Col2a1和Tlx1。然而，研究人员的EB诱导条件有利于MES，并且可能无法忠实地再现S.Ect的轨迹。最后，轨迹再次分叉，形成MES和BP终端分支。其中，MES群体由类中胚层标记（如Postn、Nrp1和Igfr2）定义，BP群体由Tal1、Cdh5和Esam定义。
因此，对EB单细胞转录组的无偏分析揭示了一系列细胞状态和轨迹，这些状态和轨迹概括了着床前发育和早期胚胎发生的关键特征。研究人员的数据支持这种体外系统在早期发育程序及其表观遗传决定因素的建模和功能方面的价值。
图3.分化轨迹的转录动力学。（A） 第一个主要细胞谱系分支的示意图。（B） 热图显示（A）中600个单细胞转录程序的无偏聚类。（C） 显示了（B）中每个基因表达模块的平均表达。（D） 第二个主要细胞谱系分支示意图。（E） 热图显示（D）中800个单细胞转录组转录程序的无偏聚类。（F） 图显示了（E）中每个基因表达模块的平均表达。
4 时间段内基于重组的系统条形码细胞
研究人员试图验证单细胞转录组有序图所暗示的轨迹结构。最初探索了基于细胞分裂过程中进化的条形码的遗传记录，但无法在原肠胚形成前的狭窄时间段中产生足够的多样性。因此，研究人员建立了一个条形码系统，并利用Cre诱导。
研究人员采用纳米孔测序（图4A）进行了调整。首先克隆了一个包含10个串联LoxP位点。尽管Cre诱导理论上可以产生180万种可能的重组LoxP，但研究人员观察到一组相对有限的重组事件具有很强的偏差（图4D，左图）。因此，研究人员用10个随机核苷酸的静态条形码在10个串联LoxP位点的两侧，以确保谱系追踪的足够复杂性。将时态（LoxP）和静态（UCI）条形码统称为时间邮戳。在研究人员的策略中，这个邮戳是从基因组DNA中读出的，因此在分化过程中不会因为沉默而受到损害。
研究人员以低MOI将时间邮戳、LoxP-RFP-STOPloxP-GFP和单独的Cre-ERT2构建整合到ESC中（图4A）。通过添加他莫昔芬30分钟，然后快速冲洗在第0天诱导重组（ESC），并让EB分化14天。研究人员修改了CEL-seq2方案，从同一单个细胞扩增mRNA和DNA时间邮戳条形码。这种扩增过程产生附加在细胞识别条形码（CB）上的cDNA和附加在CB上的时间邮戳。然后，使用Illumina对cDNA进行测序，使用长序列读长纳米孔对时间邮戳（2.5 kb）进行测序。图4B约5000个UCI相对均匀分布后，研究人员检测到具有预期长度的串联loxP条形码，并在第14天从共4224个细胞的10个loxP中获得了155个独特的重组结果（图4C、4D）。当将LoxP重组和UCI结合在一起时，可检测到514个独特的时间邮戳条形码（图4D），与其他条形码技术相当，并且比原来的Polylox策略增加了5倍。这些基准测试实验表明，时间邮戳LoxP条形码和静态UCI条形码的组合提供了足够的复杂性，在EB时间过程中从大约1000个ESC开始唯一地标记细胞。
图4. 定义时间窗内基于重组的系统条形码细胞。（A）描述从每个单个细胞获取转录组和时间邮戳条形码信息的过程。（B） 黑色柱状图显示从NGS数据计算的条形码分布。（C） 显示Cre-ERT2诱导后长序列读长长度分布的条形图。（D） 饼图显示唯一loxp重组条形码的数量（左）和唯一loxp重组条形码+UCI的数量（右）。
5 时间邮戳条形码支持EB中的沿袭关系
研究人员探讨了时间邮戳系统在EB中验证细胞谱系关系的潜力。通过在与植入后外胚层标记基因表达峰值（第8-9天）对应的时间点将其暴露于他莫昔芬30分钟来产生EB并诱导重组。在平行对照组中，在EB时间过程的第0天（ESC）诱导重组。在第14天采集细胞，进行平行转录组分析和长序列读长DNA测序，分别得到表达谱和时间邮戳条形码（图5A）。共11个EB获得了4224个单细胞的高质量转录组学数据。
在第14天确定了5个不同的细胞群，它们对应于初始轨迹中的终末分支点：EN、S.Ect、MES、Bs和PGC样细胞（图5B），没有胚外前体细胞，这些细胞在第14天丢失。此外，所有主要细胞谱系都存在于每个EB中。为了保持细胞谱系注释的一致性，研究人员使用了一种随机森林机器学习算法，通过细胞与原始时间过程中注释的细胞状态的相似性对实验中的细胞进行分类（图1）。分类方法在PGC、EN、MES和BP群体中表现良好，相关分析证实了与胚胎组织的一致性。值得注意的是，新的数据集包含的第14天细胞比原来的时间过程多20倍，这使研究人员能够区分BP样细胞群中的红细胞和髓样细胞。
从长序列读长中获得时间邮戳条形码。整合重组的loxP序列、UCI和细胞条形码能够区分总共3331个细胞的时间邮戳条形码。然后过滤出具有低复杂性、高度代表性的时间邮戳条形码的细胞。研究人员还排除了具有低置信度细胞谱系分配的细胞。研究人员的最终数据集由435个细胞组成，这些细胞具有高置信度的时间邮戳条形码和基于转录组的谱系分配（图5C）。
根据转录组数据推断的轨迹表明，植入前的外胚层样细胞在第8-9天不再存在，此时时间邮戳条形码因重组而多样化。因此，条形码重组发生在植入前外胚层样细胞的主要分支形成植入后外胚层样细胞和PGC样谱系（图3D）之后，以及在表达原始多能性模块之后。当研究人员检查在第14天收获的细胞之间时间邮戳条形码的分布时，发现许多条形码在EN、S.Ect和MES谱系之间共享，但是PGC样细胞包含一组不同的条形码（图5G–5I）。通过改变条形码分配的置信阈值和观察到的预期富集分析来验证这些谱系关系。与此形成鲜明对比的是，在第0天诱导重组（ESC）的对照实验中，所有细胞群共享时间邮戳条形码（图5D–5F）。这些数据有力地表明，EB中PGC样细胞状态是在着床后外胚层标记基因表达之前指定的，并且来源于着床前的外胚层样细胞。
这个条形码重组实验也提供了第14天EB中鉴定出的BP样细胞。髓样BP细胞仅与MES共享条形码，这与MES的来源一致（图5G–5I）。然而，幼红细胞系样BP细胞含有一组有限的不同条形码，这表明该群体可能在第8-9天重组事件之前。值得注意的是，这些细胞还表达胚胎珠蛋白基因Hba-x、Hbb-y和Hbb-bh1，可能与卵黄囊来源的原始造血细胞一致。研究人员强调这种解释是由于检测到的有限数量的条形码BP细胞造成的。然而，这些数据确实支持EB中髓样BP细胞的MES来源，并提高了幼红细胞样细胞的早期胚胎来源的可能性。
这些数据和分析提供了对可变的EB谱系的分化轨迹，并证明了基于时间控制的重组条形码系统在细胞分裂数量有限时用于追踪谱系关系的独特优势。这种重组系统特别适合于EB和其他快速分化系统。
图5. 时间邮戳条形码支持EB中的沿袭关系。（A） 演示了时间邮戳条形码生成的实验设计。（B） 热图显示了基于（A）实验中4028个单细胞转录组的前10个差异表达基因的无偏聚类。（C） 显示每个沿袭中标识的时间邮戳条形码数量的饼图（左）。18%的已识别条形码是跨不同谱系共享的（中）。小提琴图表示每个共享条形码在不同单元格中的计数次数。（D） 显示ESC中条形码生成预期结果的示意图。（E） 连锁图（左）显示在ESC中生成条形码时观察到的细胞连锁图。热图（右）显示了检测到的条形码在细胞谱系上的相关分数。（F） 示意图描述在ESC中生成条形码时共享的细胞谱系起源。（G） 显示8/9天条形码生成预期结果的示意图。（H） 连锁图（左）显示8/9天生成条形码时观察到的细胞连锁图。热图（右）显示了检测到的条形码在谱系上的相关分数。（I） 示意图描绘了在第8天生成条形码时细胞谱系的不同起源。
6 DNA甲基化在一个狭窄的发育窗口中驱动细胞的命运选择
PGC在植入后的外胚层中在成熟多能性出现时出现。植入过程中从原始多能性到成熟多能性的转变伴随着DNA甲基化的显著增加。与此相反，上述实验表明，在EB中，PGC样细胞起源于植入前的外胚层样细胞，它们仍然保持着原始的多能干细胞状态。因此，研究人员试图了解影响EB中PGC样细胞和植入后外胚层样细胞命运选择的表观遗传决定因素。
随着细胞从着床前的外胚层样状态向着床后的外胚层样状态发展，它们增加了DNA甲基转移酶的表达，降低了DNA去甲基化酶的表达。相反，随着细胞拟时间向PGC样谱系进展，DNA甲基转移酶的表达仍然较低，而DNA去甲基酶的表达则适度增加（图6A）。这些EB来源的PGC样细胞的转录状态与植入前外胚层的转录状态比植入后外胚层的转录状态更为相似，并且它们的整体甲基化水平也较低。因此，研究人员认为DNA甲基化的相对缺乏促进了植入前外胚层样EB细胞的PGC样细胞特异性。
为了验证这一点，研究人员在EB形成的整个过程中使用了低甲基化剂5-氮胞苷（5-aza；100nm）。在多个时间点进行了单细胞测序，并分配如图1和图5所示的细胞谱系身份。用低甲基化试剂处理导致向PGC样细胞谱系的显著转变（图6B）。尽管对照EB中有2%的细胞是PGC样细胞，但在5-aza处理后，该谱系占细胞总数的30%（图6B）。此外，研究人员观察到在处理条件下完全没有胚层形成，所有细胞都接近多能性的原始状态（图6B）。
EB中5-aza处理后显著上调的基因在体内外胚层、PS和MES谱系中往往受到抑制（图6C）。此外，PGC特异性（如Dppa3、Tet1、Gstm2、Trdrd12和Dnmt3l）和原始多能性（如Zfp42和Nanog）基因的启动子在体内外胚层、PS和MES谱系中甲基化（图6C）。这些数据表明，DNA甲基化是抑制原始多能性基因和PGC程序的关键。与早期植入前发育相关的低甲基化时间窗口对于维持原始的多能性和PGC规范的能力至关重要。
最后，研究人员精确地定义了DNA甲基化对PGC和植入后外胚层样命运选择至关重要的时间窗口。在EB形成过程中再次诱导低甲基化，在第4天或第6天开始5-aza处理。然后，在第14天收获细胞，并进行如上所述的单细胞测序（图6D）。研究人员发现，在第4天引入DNA低甲基化，此时原始的植入前外胚层样细胞仍然存在，但在经典的植入后外胚层或PS标记基因表达之前，适度地将PGC样细胞部分增加到4%，并且强烈地将EB向EN/VE倾斜（图6E、6F）。相比之下，在植入后成熟的外胚层出现后的第6天引入低甲基化对谱系分布基本上没有影响（图6E和6F）。同样，在没有EB分化的条件下，5-aza处理培养的ESC产生少于1%的PGC样细胞。这些数据进一步支持了以下结论：在原始的植入前外胚层样细胞中DNA甲基化有利于植入后外胚层样状态，部分是通过抑制PGC样转录程序实现的。当成熟的多能外胚层状态建立后，DNA甲基化不再需要维持谱系特异性转录程序，并且低甲基化不能重新编程这些细胞以获得原始的多能干性和PGC的能力。
图6. DNA甲基化在一个狭窄的发育时间窗口中驱动细胞的命运决策。（A） 上图：代表细胞谱系轨迹的示意图。左下：图2D中的拟时间轨迹图，描绘了前Epib细胞（橙色）、PGC样细胞（黄色）和后Epib细胞（石灰绿色；变成PS，深绿色）之间的分支点。右下：显示DNA甲基化和去甲基化机制的平均表达。（B） EB用5-aza处理并自发分化至第14天。（C） 热图（左）显示5-aza处理EB后顶端上调的基因。热图（中间）显示，相同的基因在体内分化过程中下调。热图（右）显示相同基因的启动子在体内分化过程中甲基化。（D） 描述在不同时间点DNA甲基化干扰的实验设计的插图。（E） 5-aza处理的细胞和DMSO处理的对照细胞映射在图1B的EB轨迹上。
讨论
几十年来，通过标记基因分析，哺乳动物胚胎发生的谱系层次已经深入描述。最近在单细胞转录组学和谱系追踪方面的技术发展使得细胞状态和转变的表征具有前所未有的分辨率。在这里，研究人员使用EB类器官模型来映射和干扰转录和表观遗传程序，这些程序是细胞命运规范的基础。在14天的EB分化过程中获得了大量的单细胞测序数据，并使用层次聚类、Monocle 2和机器学习来推断细胞状态和谱系轨迹。然后，采用时间邮戳遗传记录系统在狭窄的时间窗口中生成细胞特异性条形码，并在这个高度动态的系统中验证关键的发育分支点。从与原始植入前外胚层样细胞非常相似的细胞中鉴定出PGC样细胞状态的早期特征。研究人员发现，这个关键的规范事件是严格控制的DNA甲基化，在一个精确的时间窗口的植入前外胚层样细胞沉默PGC程序。研究提供了对原肠胚形成前细胞命运决策，以及一套在快速分化系统中绘制谱系关系的工具。
单细胞转录组学和细胞拟时间分析是推断谱系关系的一种有效方法，通过直接的谱系追踪方法进行验证。使用单细胞测序对每个细胞的6000个基因进行了定位。这种高转录组覆盖率增加了谱系分配的能力，特别是对于处于过渡状态的细胞。研究人员还创新了用于谱系追踪的时间邮戳条形码系统，该系统可以快速重组，而基于CRISPR的条形码需要许多细胞分裂才能拥有复杂性。研究人员通过结合单细胞测序和长序列读长测序从同一单个细胞中读出转录组和时间邮戳条形码。一个关键的创新是增加了一个UCI，能够识别和控制过于频繁的重组事件，从而减少假阳性。此方法很容易扩展到其他快速分化系统或单细胞测序技术。
研究人员的轨迹分析和谱系追踪表明，EB来源的PGC样细胞起源于一种原始的多能性植入前外胚层样状态。这与E6.25时成熟的多能干细胞植入后外胚层中PGC的出现形成对比，后者几乎与PS的出现同时出现。这可能是EB模型的局限性，它缺乏发育中胚泡的空间线索。然而，最近的研究描述了正在发育的外胚层中的多能干细胞状态的连续体，包括产生单能干生殖细胞的中间或“形成”过程多能干状态。事实上，EB中的植入前外胚层样细胞与这种中间/形成性多能干细胞状态非常相似。因此，在没有植入后囊胚环境的空间线索的情况下，EB中原始的植入前外胚层细胞已经为PGC的形成做好了准备。
最后，研究人员的数据为DNA甲基化在植入前发育中指导谱系命运的机制提供了具体的见解。研究人员发现启动子甲基化抑制了EB植入前外胚层样细胞的原始多能性和PGC转录程序，并有利于植入后和成熟多能性程序。结合单细胞转录组学数据，研究支持了这样一个假设，即原始的植入前外胚层细胞通过其不同的DNA甲基化在表观遗传学上为不同的细胞命运做好准备。事实上，体内的多能干外胚层细胞早在E4.5就已经为ECT命运做好了准备。研究人员的数据还表明，DNA甲基化仅在原始植入前外胚层样状态下对谱系规范起关键作用。当成熟的植入后外胚层转录状态被设置时，在没有DNA甲基化的情况下，所有其他谱系特异性转录程序仍然可以驱动。在这些细胞中诱导低甲基化不会使它们获得原始的多能性和PGC形成能力，这与其他染色质和转录机制在增强植入后谱系中的重要性增加一致。综上所述，当其他表观遗传机制变得突出时，在体内外胚层中观察到的DNA甲基化的增加可能会影响原始植入前外胚层细胞在成熟多能性出现之前的命运。尽管研究人员的数据强调了低甲基化在促进PGC细胞规范化中的作用，但它们并不能区分PGC前体是在着床前外胚层内维持低甲基化的基因组，还是经过一个短暂的高甲基化状态。
结论
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