科研 | J. Inflamm. Res.：蝉翼藤衍生的黄原酮通过调节PPAR-γ信号通路保护胶原性关节炎雄性大鼠关节免受损伤
编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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蝉翼藤是我国治疗炎症性疾病和骨折的传统药材。我们之前已经证实了不食链球菌的黄原酮富集部分(xanthone-enriched fractions of S. inappendiculata ，XRF)具有抗风湿作用，但其关节保护作用的机制仍不清楚。我们采用XRF对胶原诱导性关节炎(collagen-inducedarthritis，CIA)雄性大鼠进行治疗，通过关节炎评分变化、足爪形态观察、组织学检查及血清学分析评价XRF的治疗效果，然后我们采用免疫组织化学和免疫印迹法检测组织和细胞中蛋白的表达，RT - qPCR法检测mRNA的表达，LC-MS法检测血清中的代谢物，并采用关节匀浆液通过基因组微阵列分析寻找可能的靶向基因。结果显示，XRF和甲氨蝶呤(MTX)治疗后关节炎评分明显下降，CIA大鼠足爪变形减轻；此外，XRF和MTX降低CIA大鼠血清循环TNF-α、IL-1β和IL-17α，下调CIA大鼠关节TLR4 / NF-κB和JNK通路。与MTX相比，XRF微乳对关节有明显的保护作用，同时伴随着MMP3的显著降低。基于差异基因的KEGG富集和代谢组学分析表明，XRF通过调控PPAR-γ信号降低脂肪酸的生物合成。蝉翼藤衍生的1，7 -二羟基-3，4 -二甲氧基黄酮(XAN)在巨噬细胞中上调PPAR-γ表达，但在体外预脂肪细胞中抑制其表达，这与SIRT1变化同步；前脂肪细胞中脂联素的产生和SCD-1的表达也降低。除直接抑制成滑膜细胞中MMP3的表达外，巨噬细胞-脂肪细胞共培养系统中XAN的存在进一步增强了这种作用。本研究揭示了蝉翼藤生物活性组分对CIA大鼠的联合保护作用优于MTX，并证明蝉翼藤衍生的黄原酮通过调节PPAR-γ信号控制的代谢免疫反馈抑制炎症环境下，对滑膜成纤维细胞具有侵蚀性。
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实验设计
1. 通过比较XRF悬浊液(XRF suspension，XRF-SU)和XRF乳液(XRF loadingmicroemulsion，XRF- ME)的形式，探究XRF载药形式对CIA大鼠的治疗影响；
2.通过组织学检查(SOFG染色、软骨和骨骼分别为粉红色和绿色)、免疫组化季检验、免疫印迹法、RT-qPCR法探究XRF是否影响CIA大鼠关节巨噬细胞极化的作用；
3. 通过基因组芯片分析探究XRF对CIA大鼠治疗作用的调控通路；
4. 采用液相色谱-质谱联用法分析XRF治疗的CIA大鼠血清中的代谢物，以了解XRF是否改变了CIA大鼠的脂质代谢。
实验结果
1.乳液(microemulsion，ME)系统提高XRF的抗风湿潜力
我们以100 mg/kg的最大剂量给药，发现对小鼠无明显毒性，此外，我们还发现长期以80mg/kg的XRF治疗也证实大鼠是安全的，而与这些观察结果一致，本研究中50 mg / mL的XRF无论是以XRF悬浊液(XRF suspension，XRF-SU)还是XRF乳液(XRF loading microemulsion，XRF- ME)的形式均未引起受试动物的任何异常反应。
之前曾有研究考察过XRF对CIA的治疗效果，在本研究中，我们进一步强调了XRF-ME比XRF-SU的治疗优势。我们发现初次免疫后约30天左右出现自发性CIA缓解，而后期难以观察到促炎细胞因子的增加及炎症表现，因此，实验持续时间定为升压皮下注射后28天。如图1A所示，CIA大鼠的体重增长持续且显著低于健康正常对照大鼠，而MTX和XRF-SU能有效恢复CIA大鼠的体重；然而，CIA对照组和XRF-ME治疗的大鼠之间没有差异。虽然XRF的整体疗效似乎弱于MTX，但XRF- ME治疗也能显著降低关节炎评分。所有检测的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-17α在XRF-ME和MTX处理下均显著降低，而XRF-SU的效果最弱(图1B)，因此，经XRF-ME和MTX处理后，大鼠后爪形态明显恢复，但仍可观察到xrf - su处理后大鼠球根肿胀和关节变形(图1C)，且关节炎相关的组织学改变也得到改善；从XRF-ME处理的大鼠完整的软骨中可以看出，XRF对关节的保护作用甚至优于MTX (图1D)。这些证据表明，ME给药系统在体内发挥了XRF的生物活性，因此，后续的机制研究主要在XRF-ME处理的大鼠上进行。
2.XRF改变CIA大鼠关节巨噬细胞极化
H&E染色的组织学观察初步显示出XRF-ME具有有效的关节保护作用，为了证实这些发现，我们专门用SOFG染色软骨和骨骼。我们发现健康对照组大鼠软骨下结构完整，被连续软骨层覆盖，而CIA大鼠软骨下结构完全紊乱(图2A)，CIA对照组大鼠出现广泛退化和骨/软骨融合异常，这些病理变化反映在关节强直中。虽然MTX缓解了关节间隙狭窄，但几乎没有改善骨/软骨侵蚀；然而，XRF-ME治疗可显著改善关节损伤，尽管其对促炎细胞因子增加的作用不如MTX有效。
由于我们认为前炎性巨噬细胞激活FLSs并启动关节组织降解，我们研究了M1极化的两个重要指标——滑膜p-p65和IRF5的表达。CIA对照大鼠p-p65和IRF5表达增加，这是NF-κB激活和巨噬细胞不平衡极化的有力证据(图2A)。毫无疑问，作为一线药物DMARD、MTX有效地遏制了这些变化，XRF-ME应该也有相似效应。我们进一步采用免疫印迹法检测滑膜p- JNK、JNK、p-p65、p65、MMP3和TLR4的蛋白表达，结果与免疫组织化学检测结果相似，MTX和XRF- ME均抑制JNK和p65磷酸化，降低TLR4表达(图2B )，而只有在XRF - ME处理下，关节降解的直接执行者MMP3才显著降低，这进一步证实了蝉翼藤比MTX更有效的保护关节(图2C )。我们对滑膜进行RT-qPCR分析进一步验证了治疗对巨噬细胞的影响，与MTX类似，XRF-ME有利于mRNA ARG-1和IL-10的表达，但它抑制iNOS和IL-1β的表达(图2D)。XRF在影响巨噬细胞极化方面并不优于MTX，表明XRF- ME处理下MMP3表达的显著降低可能是由FLSs介导的，其中，FLSs是另一个影响RA关节降解的关键因素。此外，这些观察暗示MTX和XRF对RA/CIA的治疗机制不同，这一假说得到了我们最近研究的支持。MTX通过激活腺苷受体抑制免疫细胞中几种典型的促炎途径，因此，XRF可诱导CIA大鼠MMP3含量下降，其机制在很大程度上独立于JNK和NF-κB通路。
3. PPAR通路调控参与XRF对CIA大鼠的治疗作用
基于基因组芯片分析结果，CIA组与XRF-ME组比较共筛选出735个差异基因，接下来的GO富集表明XRF处理对细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)的生物合成有深刻的影响(图3A)。CIA大鼠经XRF-ME改变的一些代表性ECM基因以热图的形式显示在图3B中，它们大多属于胶原家族，而胶原家族是骨重塑所不可缺少的，XRF通过上调胶原蛋白和其他骨外基质的产生来缓解关节降解是非常合理的。KEGG富集分析显示，除RA和ECM受体通路外，XRF-ME处理后PPAR信号的改变最为显著(图3C)。由于PPAR（特别是PPAR-γ）深入参与代谢和免疫调节，这些发现表明XRF具有独特的抗风湿性机制，而需要特别指出的是，XRF对下游靶点的作用完全不同：XRF下调SCD-1、MMP-1、AQP7和CYP4A1，上调FABP3、CPT-1、PGAR和Penlipin(图3D)。
图3 基因芯片分析结果
(A) CIA和XRF-ME组差异基因富集GO通路(蓝箭头:蛋白质细胞外基质和ECM通路);(B)两组有代表性的ECM基因表达水平。(C) KEGG通路富集(蓝箭头:类风湿关节炎和rar信号通路);(D) XRF调控的PPAR信号相关基因(KEGG注释，绿色:下调，红色:上调)。
4. 基于LC-MS分析血清的CIA大鼠XRF改变脂质代谢
人们普遍认为PPAR控制脂质新陈代谢，所以采用液相色谱-质谱联用法分析XRF治疗的CIA大鼠血清中的代谢物，以了解XRF是否改变了CIA大鼠的脂质代谢。基于代谢产物的PCA结果表明，XRF-ME组和CIA组有明显的差异；同时，散点图中质控样品的曲线完全重叠，这表明了分析方法的稳健性，以及在XRF-ME治疗下CIA大鼠代谢谱的改变。OPLS-DA证实了XRF对CIA大鼠脂质代谢的影响(图4A )。在鉴定出的代谢物中，我们筛选出质谱正负模式选择下的73个和59个信号（p<0.05，VIP>1），两组间差异有统计学意义，并进行进一步聚类分析；而同一组样品利用从正负模式获得的数据进行聚类，暗示了这些代谢产物的区分情况(图4B )，这些差异代谢物大多属于脂类和小肽。如图4C所示，XRF测定的所有游离脂肪酸（FFA）以及磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰胆碱（PC）衍生物等类脂显著减少。目前已证实饱和FFAs通过激活TLR4信号通路促进炎症反应，而XRF-ME治疗下减少的十八酸可能有助于CIA大鼠炎症的缓解；更重要的是，XRF对循环丙二酰辅酶A和脂肪细胞大小的负面影响暗示XRF可能抑制体内脂肪生成。有文献报道PC的快速转换与脂肪组织的炎症具有相关性，因此，我们在XRF-ME治疗下观察到的减少的LysoPC (22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))，LysoPC(16:0)和PC (O-14:1(1E)/0:0)似乎有利于控制慢性炎症和肥胖相关症状。由于RA患者通常会出现高脂血症和中枢性肥胖，XRF可通过抑制脂质合成代谢来改善CIA大鼠的炎症反应。XRF对多肽的作用是多种多样的，我们根据改变的多肽与软骨中主要成分CII的相关性对其进行了分类，众所周知，CII成分富含甘氨酸和脯氨酸，但缺乏色氨酸，但所有包含脯氨酸或甘氨酸的肽都被XRF还原了，而其他多肽，特别是含有色氨酸的多肽大量增加。我们在这项研究中检测到的7个增加的肽中有3个含有色氨酸残留，暗示XRF有选择性地阻止CIA大鼠CII降解。
图4 LC-MS分析血清代谢产物
(A)基于PCA和OPLS-DA分析的CIA和XRF-ME组代谢谱差异概述;(B)负离子和正离子模式下检测到的差异代谢物热图。( C )按类别显示的代表性代谢物：a、FFAs、b、脂类、c、小肽经XRF增加(黑箭头：含色氨酸的肽)、d、小肽经XRF减少(黑箭头：含甘氨酸的肽、红箭头：含脯氨酸的肽)。
5. FLS不是XRF涉及PPAR-γ调控的直接靶标
FFAs的生物合成受到PPAR-γ的选择性控制，LC-MS分析结果表明XRF可能对PPAR-γ有影响。由于PPAR-γ受到SIRT1的严格控制，我们研究了大鼠滑膜中PPAR-γ和SIRT1的表达，发现与MTX相比，XRF明显提高了PPAR-γ的表达，而SIRT1被XRF和MTX抑制(图5A)，进一步证明了XRF能够激活PPAR-γ信号，SIRT1和PPAR-γ对彼此的表达具有反向的负作用。如上所述，FLSs可能是XRF的主要治疗靶点，这也解释了其对关节的保护作用。随后，我们在体外研究了XAN对FLSs的影响，以观察其对PPAR-γ信号通路的调控作用。为了模拟炎症条件，我们用LPS预处理正常的FLSs，因为它们表达TLR4；然而，由于PPAR-γ的选择性分布，我们用免疫印迹法检测PPAR-γ的表达过低。XAN降低了MMP3及其上游信号的水平，但仅在高浓度(高于5 μg/mL)时才如此(图5B)。虽然MTX和XRF都抑制了NAMPT的表达，但其下游的SIRT1几乎没有受到影响(图5C)，因此，由于PPAR-γ的低表达，我们基本排除了XRF处理下FLSs相关PPAR-γ调控导致关节保护作用的可能性。此外，许多研究证实黄酮的口服生物利用度较差，这些成分进入关节的传递更加困难，这意味着，XRF-ME治疗后观察到的关节损伤减少可能是由于免疫微环境的改善。这也就是说，XRF可以调节外周细胞PPAR-γ信号通路，从而改善FLSs所需的炎症免疫环境，维持其侵蚀性。
图5 XAN治疗CIA大鼠及FLSs的滑膜免疫印迹分析
(A)不同处理下CIA大鼠滑膜中PPAR-γ和SIRT1的表达;(B) LPS处理的FLSs中蛋白MMP3、SIRT1、NAMPT、p-STAT3/STAT3和p-JNK/JNK的表达;(C)图像量化结果(B)。
6. XRF通过调节PPAR-γ信号通路改善免疫环境
考虑到在RA条件下骨髓型细胞即巨噬细胞中PPAR-γ广泛表达，我们假设XRF主要调控骨髓型细胞中PPAR-γ的表达；同时，PPAR-γ被前脂肪细胞高表达，在脂肪代谢稳态中发挥核心作用，并在炎症环境下与巨噬细胞广泛相互作用。考虑到它们的相互作用和显著的免疫意义，我们在共培养系统中用XAN在LPS存在下处理巨噬细胞和前脂肪细胞。很明显，在共培养的情况下，LPS对两种细胞的刺激被夸大了，但XAN对巨噬细胞和前脂肪细胞的整体作用完全不同，XAN降低了前脂肪细胞中的PPAR-γ，增加了SIRT1，但在巨噬细胞中我们观察到了相反的作用(图6A)。由于PPAR-γ促进巨噬细胞M2极化，XAN引起的这一信号的上调可能有助于缓解炎症。正如预期的那样，XAN恢复了LPS诱导的mRNA iNOS、ARG-1、IL-1β和IL-10表达的变化，而选择性PPAR-γ抑制剂T0070907则大大拮抗了这些作用(图6B)，这基本证实了XAN可以通过激活巨噬细胞体内或共培养系统中的PPAR-γ信号来改善免疫微环境。为了弄清楚巨噬细胞和前脂肪细胞之间的相互作用以及XAN对关节的影响，我们用共培养系统收集的培养基培养FLSs。在共培养过程中，大部分的XAN已经被分解和清除，剩余的XAN含量太低，无法用UPLC-UV(补充S8)检测，因此，它在很大程度上排除了XAN直接刺激的干扰。RT-qPCR分析表明，炎症条件下收集的培养基诱导MMP3表达显著增加，而共培养系统中XAN的存在有效地消除了这一趋势(图6C)。免疫印迹实验显示，XAN不仅下调了FLSs中的MMP3，而且下调了其上游的STAT3(图6D和E)，我们随后关注了共培养系统中前脂肪细胞的变化。如图6F所示，脂多糖启动的巨噬细胞促进了具有代表性的脂肪因子脂联素的合成，而XAN的共存则显著降低了脂联素的合成。RT-qPCR分析表明，XAN下调了PPAR-γ下游的SCD-1，这也是FFAs生物合成的关键调控因子(图6G)。一般来说，XAN通过调节PPAR-γ干预脂肪形成，而XAN刺激下巨噬细胞和前脂肪细胞的不同结果也为XRF对PPAR信号下游靶点的不同作用提供了证据。
图6 XAN对体外共培养的前脂肪细胞和巨噬细胞PPAR-γ信号的调控及其对FLSs的影响
(A)用免疫印迹法研究单一培养系统或XAN刺激下联合LPS培养的前脂肪细胞和巨噬细胞中SIRT1和PPAR-γ的表达;(B)采用RT-qPCR方法研究选择性PPAR-γ抑制剂T0070907对xan诱导巨噬细胞PPAR-γ、iNOS、ARG-1、IL-1β、IL-10 mRNA表达变化的影响;(C)采用RT-qPCR方法检测LPS处理或脂肪前巨噬细胞共培养系统或与XAN一起培养的FLSs中MMP3 mRNA的表达;(D)采用免疫印迹法研究MMP3、p-STAT3/STAT3、p-JNK/JNK蛋白在FLSs中的表达;(E)鉴定结果(D);(F)在LPS存在或与XAN共同培养系统中，前脂肪细胞释放的脂联素，ELISA法检测;（G）通过RT-qPCR研究从测定（F）获得的前脂肪细胞中SIRT1，SCD-1和PPAR-γ基因的表达。 测定（A）中XAN的浓度单位为μg/ mL；测定中所用的XAN浓度（B–G）为5μg/ mL。
讨论
在黄原酮处理下，Th17/Treg细胞和Th1/Th2细胞的失衡比例得到恢复。由于类风湿关节炎被认为是一种CD4+淋巴细胞驱动的疾病，这些发现坚定地证实了其抗风湿的潜力，研究者已经提出许多理论来解释它们对适应性免疫的影响，其中，单核/巨噬细胞介导的机制似乎是比较有说服力的。在病理条件下，控制巨噬细胞的数量或极化都是阻断适应性免疫异常激活的可行途径。在10μg/mL以下，XAN对巨噬细胞无明显的细胞毒性。黄原酮在口服后的分布较低，表明XAN通过非细胞毒性的方式减轻巨噬细胞控制的炎症。无毒浓度的α-芒果素对NF-κB通路的有效抑制作用初步支持了这一观点。随后，我们研究了XAN与TLR4的直接相互作用确定为TLR4/NF-κB活化是M1极化过程中的一个重要分子事件，这种信号转导的改变必然损害巨噬细胞作为抗原提呈细胞的功能，从而阻碍适应性免疫的启动。在XRF - ME处理的CIA大鼠中，RT1-Ba (一种MHCⅡ分子)的表达显著降低，进一步证实了黄原酮对M1极化的抑制作用(补充S9 )。结合图2所示的证据，我们认为S-XANs对巨噬细胞的抑制作用至少部分地促进了大鼠CIA的缓解。
越来越多的证据证实巨噬细胞参与代谢紊乱，由巨噬细胞引发的低级别炎症显著促进了肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化，同时，加速的能量代谢会引发炎症反应。脂肪生物合成和利用的增加有力地促进了RA的发展，代谢综合征与巨噬细胞相关的关节退化呈正相关，其中免疫反馈可能是RA病理改变的基础。如图6所示，巨噬细胞-前脂肪细胞共培养系统放大了LPS和XAN对FLSs的影响，这说明XRF/XAN除了直接抑制TLR4/NF- κb控制的M1极化外，还通过靶向共存的脂肪细胞，进一步增强了对促炎巨噬细胞发育的影响。
如前所述，蝉翼藤对能量代谢有深远的影响，其中XRF明显抑制CIA大鼠脂质合成代谢。本研究的基因组芯片分析进一步表明，XRF显著下调了一组与脂肪发生相关的基因，包括Ces1d、Thrsp、Lpin2、SCD-1、Fasn、Tmem120b和Acvr1c(补充S9)。更有说服力的证据来自代谢组学分析(原始数据在补充S10-S11中显示)，结果显示XRF-ME治疗可显著降低CIA大鼠的脂质水平(图4)，我们也在体外实验中验证了这一现象，XAN不仅抑制了前脂肪细胞中SCD-1和PPAR-γ mRNA的表达，而且还显著降低了脂联素的产生(图6)。这些代谢变化会对体内环境产生很大的影响：首先，脂质储备的减少会削弱巨噬细胞的防御免疫功能，因为这些成分是吞噬功能和促炎介质合成所必需的；此外，XAN对脂肪形成的负面作用可以间接改变巨噬细胞的极化形态，而抑制脂肪生成往往伴随着循环饱和FFAs的减少，具有激活巨噬细胞中TLR4/NF-κB的潜能；减少脂肪因子具有更深刻的临床意义，脂肪因子在RA等许多炎症相关疾病中的病理作用已基本得到证实，尽管脂肪因子重塑巨噬细胞的机制尚不清楚，但它们对免疫的影响是巨大的。除了典型的脂肪因子外，许多巨噬细胞相关的细胞因子如MCP-4和MIP-1也被定义为脂肪因子。从这个角度来看，抑制脂肪细胞的排泄是一种应对巨噬细胞控制的体内炎症的可行策略。在本研究中，巨噬细胞和前脂肪细胞位于小室的不同腔室中，它们之间的孔只能允许脂肪因子/细胞因子和代谢产物渗透，因此，XAN在共培养系统中增强的显著抗炎作用支持了上述说法。综上所述，这些证据证实了XRF通过破坏巨噬细胞与脂肪细胞之间的相互作用来增强其抗炎作用。
因为XRF有效地改变了脂质代谢，所以我们发现它在CIA大鼠中调节PPAR-γ信号并不奇怪。与此相一致的是，XAN降低了体内前脂肪细胞PPAR-γ的表达，它具有抑制脂肪细胞分化的潜力，从而导致脂肪因子的减少；同时，XAN促进了前脂肪细胞SIRT1的表达，对PPAR- γ具有拮抗代谢作用，促进脂肪酸氧化。XAN刺激下，SIRT1的调控与PPAR-γ的变化相协调，普遍促进了脂肪分解代谢，创造了有利于M2极化的环境，而XAN刺激增加了巨噬细胞中PPAR-γ的表达。由于PPAR-γ具有显著的抗炎反式抑制作用，且在IL4介导的M2极化过程中是必不可少的，因此进一步有利于关节局部炎症的缓解。出人意料的是，XAN抑制了LPS启动巨噬细胞中SIRT1的表达，而SIRT1也是炎症的负调控因子，这可能是SIRT1-PPAR-γ负反馈的结果；但更可信的是，它与缓解炎症有关。SIRT1能够立即响应NAMPT引发的炎症反应，而当炎症反应得到解决时，其必要性不再迫切。在巨噬细胞和前脂肪细胞中观察到的XRF/XAN对PPAR-γ信号的相反调控对显著改善免疫环境是必不可少的，然而，导致多元化效应的因素仍然是一个有待解决的难题，这可以简单地归因于不同的细胞类型，但它也可能是由免疫变化介导的。如图6A所示，LPS启动的巨噬细胞能够显著增加前脂肪细胞中的PPAR-γ，因此，M1极化受损会降低巨噬细胞对靶细胞PPAR-γ表达的影响。为了验证这些假设，研究人员还需要做更多的工作。尽管来自基因组芯片分析和体外实验的证据表明XRF对不同类型的细胞有不同的作用，但它通常会上调CIA大鼠关节中PPAR-γ信号的表达，这可能是因为巨噬细胞而不是前脂肪细胞在关节中主导PPAR-γ表达。本研究除图3 KEGG注释的相关基因外，PPAR-γ下游的Fgf1和PPAR-γ阳性调节基因Senp2上调，而PPAR-γ负调控基因Acvr1c、Retn下调(补充S9)。
结论
本研究揭示了蝉翼藤生物活性部位对CIA大鼠的保护作用优于甲氨蝶呤。除了对炎症通路控制的巨噬细胞极化的影响外，XRF治疗还通过调节PPAR-γ信号控制的脂肪代谢对免疫微环境产生深远影响。体外实验证据进一步表明，具有代表性的蝉翼藤衍生化合物XAN可以通过干预代谢-炎症反馈来改善关节免疫环境，从而抑制炎症环境下获得的FLSs的侵蚀性。