2021年2月27日，著名喜剧演员吴孟达因肝癌去世，享年69岁。据报道，他在2020年年底才发现自己罹患肝癌，当时癌细胞已经扩散；从发现肝癌到去世仅3个月。2021年2月3日，著名音乐人赵英俊因肝癌医治无效离世，享年43岁。他在最后一篇微博里说，“经过两年多的战斗，还是输给了癌症。”面对被誉为“癌中之王”的肝癌，我们该如何应对？据统计，2020 年全球肝癌新发患者约 90 万例，死亡患者约 83 万例。其中我国的肝癌患者数量约占全球肝癌患者的一半以上，是肝癌负担最重的国家之一 [1]。肝癌发病因素包括乙肝、丙肝、酒精肝等。中国国情特殊，有约 7000 万的乙肝病毒携带者。乙肝和肝癌的关系密切，70%-80% 的肝癌是在病毒性肝炎基础上发展而来。肝癌早期一般没有特异性的症状，生活中也就容易忽略，等出现疼痛、腹胀、乏力、黄疸等时，多已是中晚期。癌症固然可怕，但只要接种疫苗、定期体检，早期肝癌还是有治愈的可能。在不久前结束的“两会”提案中，全国人大代表、山东省肿瘤医院院长于金明建议将肿瘤筛查纳入医保。于金明称，发现一个早期患者不仅能省去后面的化疗、靶向、内分泌、免疫治疗等高额医疗费用，关键能够提高治愈率。他强调，恶性肿瘤患者要抓住“肿瘤唯一治疗机会”，早发现、早诊断、早期规范治疗，如果等到肿瘤发展成晚期，以打补丁式的治疗来补救为时已晚。正常细胞发生癌变，变成肿瘤细胞。肿瘤细胞也会经历“生老病死”，肿瘤细胞中的物质可能释放到血液中，比如肿瘤细胞的 DNA，它们随着血液循环而流动，这也就是我们所说的循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）。捕获血液中的 ctDNA 可以帮助我们解读癌细胞的状况，就像我们在雪地里循着野兽的脚印去搜索它们。近年来，ctDNA 已经成为一种很有前景的癌症生物标志物。由于是基于血液，我们也将其称为“液体活检”。ctDNA 已被证明在癌症的非侵入性检测、晚期癌症的个体化治疗，以及治疗期间和治疗后的监测方面具有重要价值。DNA 我们很熟悉，但是 DNA 不是我们遗传信息的全部。我们发现，DNA 上面的一些修饰，比如 DNA 甲基化，也会影响这个基因的表达。如果这个基因正好是癌症相关基因，那么 DNA 甲基化这种修饰可能就有诱发癌症的风险。因此，检测 DNA 甲基化对于癌症的监控也十分关键。去年 7 月，中国科学院院士、复旦大学泰州健康科学研究院和人类表型组研究院院长金力院士研究团队开发的一种非侵入性的，基于 ctDNA 甲基化的多癌种筛查技术 PanSeer，该方法据称能在常规诊断前 4 年，对胃癌、食管癌、结直肠癌、肺癌及肝癌等 5 种常见的癌症做出早期检测。相关研究成果于 2020 年 7 月 21 日发表在国际著名学术期刊《自然·通讯》上 [2]。图 4. 金力院士团队的 ctDNA 甲基化的肿瘤早筛研究近日在国际著名学术期刊《细胞》的子刊《肿瘤进展》(Trends in Cancer) 上发表了题为《DNA 甲基化在肿瘤早期鉴定中的表现》的文章 [3]，我们进行了系统解读。DNA 甲基化已然成为有价值的癌症生物标志物。接下来我们重点介绍基于液体活检的 DNA 甲基化分析对癌症早期无创诊断的优势，并讨论了由商业和学术合作伙伴开发的先进分析方法。能够尽早发现癌症增加了有效治疗和适当监测疾病的机会。对于许多类型的实体恶性肿瘤，症状往往在原发肿瘤转移后才出现。因此，人们在开发可靠、无创、经济高效的常见癌症早期检测方法上付出了巨大的努力。随着人们对肿瘤发生分子机制的日益了解以及新型分子技术的迅速发展，通过所谓的液体活检——从体液中提取肿瘤来源的分子，扩大了早期非侵袭性癌症检测的范围。近年来，从血液（血浆/血清）、尿液、支气管肺泡灌洗液、乳腺抽吸液、唾液或痰等生物液体中分离出的循环细胞游离 DNA（cell-free DNA, cfDNA）受到了广泛关注。特别是循环肿瘤 DNA（ctDNA），来源于肿瘤细胞的 cfDNA 的一部分，可用于癌症检测的早期诊断。在肿瘤进展过程中，ctDNA 从凋亡或坏死的肿瘤细胞，也可能通过主动分泌释放出来，并提供有关原发性和继发性肿瘤的基因组组成信息。遗传和表观遗传的改变都参与了癌症的发展，通过液体活检检测这些改变的概念正在转变为临床现实。当前检测 ctDNA 的方法通常基于对 cfDNA 中体细胞突变的测序，这对于监测具有可操作突变的肿瘤细胞克隆是非常有价值的。然而，由于复发突变的数量有限，这些方法在早期癌症患者中的诊断敏感性可能较低。同样，肿瘤组织的克隆性和异质性降低了在 cfDNA 中检测特定体细胞单核苷酸突变的敏感性，从而稀释了循环中可检测的信号，通常在循环中检测需要超低的检测灵敏度（达到“大海捞针”的水平）。相比之下，DNA 甲基化并没有受到分子的限制，由于以下几个因素，DNA 甲基化具有更强的检测早期癌症的能力：（i）表观遗传学的改变，例如异常的 DNA 甲基化发生在肿瘤发生的早期并可能是组织和癌症类型特异性的；（ii）DNA 甲基化模式在肿瘤组织和相同肿瘤类型中广泛存在，而体细胞突变通常仅限于肿瘤细胞的亚群/克隆；（iii）DNA 甲基化在更大的基因组区域内是一致的，因此可以使用多个 CpG 二核苷酸进行检测。
图 6. ctDNA 的起源和被用于液体活检中的各种基因组改变。如图所示，外周血是液体活检最常见的来源（也可以使用其他体液）。凋亡或坏死的肿瘤细胞释放的 ctDNA 可以从简单的抽血中被分离出来，并且可以对 ctDNA 进行分析以鉴定在肿瘤中观察到的多种常见的基于 DNA 的改变，包括突变、拷贝数变异、基因融合和DNA 甲基化改变。如图的最下方所示，已经开发出了专门用于 ctDNA 甲基化分析的方法。dPCR，数字 PCR；Infinium，Infinium 人类甲基化微珠芯片；MBD，CpG 甲基化的结合域；MC-seq，甲基捕获测序；MeDIP，甲基化 DNA 免疫沉淀；MIRA-seq，甲基化 CpG 岛回收试验结合测序；Pyro-seq，焦磷酸测序；qMSP，定量甲基化特异性PCR；RRBS，简化式亚硫酸氢盐测序法；SMART，单分子实时测序；WGBS，全基因组亚硫酸氢盐测序技术。
来自血液或其他体液中的 cfDNA 可以被轻松捕获，以研究感兴趣的基因组位置的 DNA 甲基化状态。表观遗传特征可以通过多种技术进行鉴定，包括利用限制性酶或基于亲和力的方法富集甲基化或未甲基化的片段，或通过重亚硫酸盐转化区分甲基化和未甲基化的胞嘧啶。迄今为止，研究最广泛的表观遗传学改变是 CpG 二核苷酸的 5-胞嘧啶 DNA 甲基化，其高度集中在基因启动子区域内的 CpG 岛，癌症中的启动子高甲基化与抑癌基因的沉默和随后的肿瘤发生有关。每种 DNA 甲基化分析技术都有其自身的优势和局限性，但在这个快速发展的领域中，技术的进步使位点特异性 DNA 甲基化的评估变得越来越敏感和特异。一些研究已经揭示了多种癌症类型的多个肿瘤基因的诊断和预后 DNA 甲基化模式，以及一些基于 cfDNA 甲基化的表观遗传生物标志物，如大肠癌中的 VIM 和 SEPT9；PTGER4/SHOX2 与肺癌的关系以及用于前列腺癌的 GSTP1，这些生物标志物已经在临床中使用，诊断试剂盒也已上市。最近，先进的技术已经被用于捕获全基因组异常甲基化的 DNA 位点，以便从不同类型的肿瘤中识别更全面的甲基化图谱。这些 DNA 甲基化图谱可被用于创建分类器（classifiers），通过液体活检应用于无创且特异性地检测早期癌症，目前正在开发的商业应用具有改善癌症护理临床实践的潜力。一些公司开发了专用平台，可快速准确地检测 ctDNA 上的各种基因组改变。合作和伙伴关系是在临床环境中实现表观遗传学应用潜力的关键；学术专家为这些合作带来独特而宝贵的见解，而商业合作伙伴可以提供必要的投资来打包和交付新技术。一些公司现在已经使用组织和大量液体活检样品在癌症基因组信息最丰富的区域中鉴定并验证了表观遗传学标记，并通过使用机器学习算法开发了能够同时检测癌症和肿瘤的组织来源的检测方法。全球处于表观遗传发现和无创诊断应用最前沿的公司有 EpiGene、Epigenomics、ExactSciences、Freenome、Genomictree、GRAIL、GuardantHealth、Laboratory for Advanced Medicine（LAM）和 MDxHealth 等。癌症特异性表观遗传标志物的鉴定也可以阐明肿瘤发生特征性的分子途径，因此有可能使这些生物标志物应用于新疗法、伴随诊断和支持个性化医疗的技术。图 7. 基于 DNA 甲基化的肿瘤早筛公司及其产品基于 cfDNA 和 ctDNA 甲基化分析的方法为多种癌症类型的早期检测提供了新的途径，而 DNA 甲基化标记因其敏感性、特异性和易于分析而具有成为常规临床癌症生物标志物的潜力。尽管 cfDNA 甲基化分析单独用于癌症检测和监测的可行性已被成功证明，但将 cfDNA 突变标记与经典的生物化学癌症标记和/或成像技术相结合可能有助于将液体活检作为一种护理标准来实施。以表观遗传学为基础的癌症和其他疾病的诊断使早期疾病的发现成为可能，这将为疾病进展尚未影响生活质量、患者仍然健康以及状况有利于治疗取得成功的临床干预提供机会。这些高度特异性的生物标志物以及其他体细胞和生殖细胞的遗传标志物可以帮助管理个性化疾病、监控治疗反应并更精确地调整用药，从而有机会优化治疗并减少副作用。此外，表观遗传疗法已显示出有效治疗血液癌和实体癌的潜力，与免疫疗法相结合可能极大地有益于癌症治疗。随着我们对表观基因组及其可改变性，特别是对干预的反应性的理解不断加深和发展，在临床环境中创新和应用这一知识的机会也在显著扩大。在未来，这些进步可能有助于塑造我们对整个人类健康和福祉进行管理的长期方法；能够持续监控表观基因组，并有机会适应适当的生活方式或实施早期的临床干预措施，从而避免癌症等重大健康问题。1. 周泽文, et al., 原发性肝癌的全球展望：流行情况、危险因素和人群归因分值.中国癌症防治杂志, 2021. 13(01): p. 14-21.2. Chen, X., et al., Non-invasive early detection of cancer four years before conventional diagnosis using a blood test. Nat Commun, 2020. 11(1): p. 3475.3. Roy, D. and M.Tiirikainen, Diagnostic Power of DNA Methylation Classifiers for Early Detection of Cancer. Trends Cancer, 2020.6(2): p. 78-81.
