Trizol法提取RNA的方法

获得高质量的RNA对生物学下游实验至关重要，所以如何获得纯度高、完整性好的RNA就成为非常关键的一步，“落地98K一路开挂”的实验教程来了~RNA提取方法从细胞或组织中提取RNA的方法有多种，包括Trizol试剂提取法、过柱法、磁珠法等。实验室最常用的是Trizol试剂提取法。RNA提取方法试剂盒法TRIzol法优点操作简单、入门容易，新手必备。提取成本低，适用物种广泛，操作者可根据不同实验材料的特点灵活调整实验步骤达到最优的提取效果，适用于经验丰富的科研老司机。缺点柱提取法提取的RNA有长度的局限性, 小RNA在提取过程中容易丢失。另外，不同的试剂盒适用物种不同，使用时需谨慎选择。操作步骤繁琐、耗时长。实验步骤1. 样品处理（1）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min 。（2）组织：取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。置1.5ml 离心管中，加入1ml Trizol，室温静置5min。2. 相分离(1) 4°C离心, 12000g×5min（2）加入0.2ml 氯仿，剧烈振荡，待充分乳化溶液后，室温静置2min。（3）4°C离心，12000g×15min，离心后分成三层，RNA只存在于水相中。水相占总TRIZOL的60%，取上清，切勿吸入白层。3. RNA沉淀加入0.5ml异丙醇，缓慢上下颠倒充分混匀后，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 × g ，10 minutes，4°C，弃上清。离心后可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。4. RNA洗涤加入1ml 75%乙醇（使用DEPC处理水配制）洗涤RNA沉淀，切勿触及沉淀，轻轻上下颠倒洗涤，离心12000× g ，5 minutes，4°C。5. RNA再溶解小心去上清(尽量除尽乙醇)，置室温中2-5min，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。部分溶解的RNA样品其A260/280 ratio < 1.6。用无RNase 的水或0.5% SDS溶液重悬RNA沉淀（25-200μl），如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。用枪头反复轻轻吹打几次，（促溶可以静置10 min，55-60°C）。测浓度后-80°C保存。6. 测浓度取2μl 储存液加入EP管中，再加入98μl无RNase水，离心混匀，以无RNase水作空白对照，测OD260/280值。1 OD=40μg RNA。OD260/280值在1.8-2.0视为纯度很高。一般浓度在1000ng/ml较准。浓度太高要稀释以后再测定。7. RNA鉴定甲醛变性琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。注意事项1.防止样品污染所有离心管、枪头及相关溶液都必需无RNA酶污染。溶液需用灭菌的DEPC水配制。耐高温器物可150℃烘烤4小时以除去RNA酶，其它器物除RNA酶可考虑用0.1%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌、烘干；必需戴一次性手套和口罩操作，且尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。2.安全意识Trizol含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。如皮肤接触Trizol，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。3.材料的取用与保存取用原则：“现用现取”，材料离体后尽快进行RNA提取；保存条件：液氮、-80℃冰箱、干冰； 保存效果：液氮> -80℃冰箱>干冰； 样品分装：按实验需求最小量保存多份，避免反复冻融。常见问题1.RNA得率低(1) 样品裂解或匀浆处理不彻底。(2) 最后得到的RNA沉淀未完全溶解。2.OD260/OD280<1.65(1) 检测吸光度时，RNA样品没有溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高；(2) 样品匀浆时加的试剂量太少，蛋白质变性不充分；(3) 匀浆后样品在室温放置不足5分钟；(4) 相分离后，吸取上清液是不小心接触到蛋白层造成污染；(5) RNA沉淀未完全溶解。3.RNA降解(1) 使用的组织材料不够新鲜；(2) 提取的组织材料中含有大量的RNA分解酶，而Trizol的添加量不够；