【综述】无功能性垂体神经内分泌肿瘤组织病理学分类（下）：亚型、预后标志物、预测标志物

《Pituitary》杂志2018年 4月刊载[21(2):119-129.]塞尔维亚和瑞典的Manojlovic-Gacic E  Engström BE , Casar-Borota O撰写的综述《无功能性垂体神经内分泌肿瘤组织病理学分类Histopathological classification of non-functioning pituitary neuroendocrine tumors》( doi: 10.1007/s11102-017-0855-1.)。

垂体神经内分泌肿瘤不会发生与腺垂体激素高分泌相关的内分泌症状，临床表现以鞍区肿瘤肿块增大为症状特点。由于肿瘤的异质性、生物学知识的局限性和方法学的多样性等多个问题，其组织病理学分类一直具有挑战性。作者已经在PubMed数据库中搜索了与无功能性垂体肿瘤的组织病理学分类相关的数据及其应用方法。本文对WHO（世界卫生组织）最近发布的第四版《内分泌肿瘤分类》中提出的分类和分级原则进行了总结。根据垂体前叶激素和垂体特异性转录因子的表达，在临床上，无功能性肿瘤中以促性腺激素肿瘤为主，促肾上腺皮质激素类型其次;然而，其他不太常见的无功能性肿瘤也可以被识别出来。肿瘤细胞增殖的评估对于鉴别“高危腺瘤”非常重要。一些无功能性肿瘤亚型属于潜在侵袭性肿瘤的范畴，与细胞增殖率无关。在这里，作者提出了临床无功能性垂体肿瘤分类的最新标准，为常规临床应用提供了一种诊断方法，并强调在分类中纳入预后和预测标志物的必要性。表1, 无功性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）的组织病理学类型具有诊断和潜在预后/预测功能的免疫组织化学标志物无功能性垂体神经内分泌肿瘤类型转录因子激素染色低分子量细胞角蛋白（LMWCK）预后/预测标志物促性腺激素细胞SF-1 (GATA-2, ERα)β-FSH, β-LH, α-SU多变的ERα, SSTRs促肾上腺皮质激素细胞T-PitACTH弥散的1型（致密型）T-Pit（弥散，强）ACTH弥散的2型（稀疏型）T-Pit（弱，不一致）ACTH弥散的Crooke细胞T-Pit细胞周围环状的生长激素Pit-1GH纤维体SSTRs稀疏颗粒型Pit-1弥散，强弥散的致密颗粒型Pit-1弱，不一致多变的促甲状腺激素Pit-1(GATA-2)TSH，α-SU多变的SSTRs泌乳素Pit-1 (ERα)PRL多变的稀疏颗粒型Pit-1 (ERα)核周围，高尔基区域PRL多变的致密颗粒型Pit-1 (ERα)弥散的PRL多变的嗜酸性干细胞腺瘤Pit-1 (ERα)局灶的和多变的PRL,GH（不一致）纤维体多激素Pit-1aPit-1GH,PRL, TSH,α-SU多变的零细胞无无多变的双重性/三重性一个以上多变的多变的增殖性增加和MRI上证实存在侵袭性是所有高风险腺瘤类型的标准要求。甲基转移酶MGMT是所有类型的难治性垂体神经内分泌肿瘤对替莫唑胺反应的潜在预测标志物。a具有潜在难治性生物学行为的无功能性垂体神经内分泌肿瘤的类型。

无功能性垂体神经内分泌肿瘤的亚型无功能的/静默的促性腺激素细胞肿瘤是SF-1细胞谱系派生的肿瘤,通常至少显示病灶的β-FSH,β-LH,α-subunit 免疫标记。尽管现有的抗SF-1抗体存在质量不佳的方法上的困难，但核标志物通常可以在相当大比例的肿瘤细胞中检测到，这使得在促性腺激素表达稀少或不表达的情况下能够诊断。当同时使用针对促性腺激素的抗体和SF-1进行分类时，促性腺激素细胞肿瘤几乎占无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）的80%。然而，在以往的研究中，因未测转录因子，促性腺激素细胞肿瘤被低估了，通常被归类为零细胞腺瘤。它是唯一一种无功能形式占主导地位的垂体神经内分泌肿瘤。无功能/静默的促肾上腺皮质激素细胞肿瘤是与T-Pit谱系相关的肿瘤，通常ACTH表达稀少，无库欣病的临床证据[2,40,41]。它们约占无功能性垂体神经内分泌肿瘤的15%，是无功能性垂体神经内分泌肿瘤的第二大组成部分。随着抗T - Pit抗体的免疫组化应用的增加，无功能性垂体神经内分泌肿瘤中静默性促肾上腺皮质激素肿瘤的比例有望增加，从而能够识别ACTH表达稀少或无表达的肿瘤。与功能性类似，静息性促肾上腺皮质激素细胞肿瘤在形态和超微结构上可细分为致密颗粒型和稀疏颗粒型。罕见的是，Crooke细胞腺瘤具有典型的核周环状细胞角蛋白聚集，ACTH阳性转移至亚膜区(sub-membranous zone)，临床上很少表现为静默性。在肾上腺皮质激素肿瘤中，静默的促肾上腺皮质激素肿瘤转化为正常的垂体神经内分泌肿瘤(或异常情况下，反之亦然)已得到全面分析。然而，尽管有几种可能的解释，其机制仍不清楚。不依赖于其形态学变异，静默性促肾上腺皮质激素肿瘤由于其具有的侵袭性生长、卒中和复发的倾向而被认为是更具难治性临床行为的肿瘤。无功能/静默的生长激素细胞肿瘤为Pit1和GH免疫反应性肿瘤，无肢端肥大症临床表现，占所有垂体肿瘤的2-3%。根据低分子量细胞角蛋白(LMWCK) [CK7/8 (Cam5.2)和CK18]染色，可将其分为稀疏颗粒和密集颗粒型生长激素细胞肿瘤，表现为纤维体（fibrous bodies）型或弥漫性胞浆（diffuse cytoplasmic pattern）型(表1)。无功能性生长激素细胞肿瘤主要是稀疏颗粒型，与功能性生长激素垂体神经内分泌肿瘤相反。功能性生长激素垂体神经内分泌肿瘤中稀疏颗粒型和密集颗粒型肿瘤的频率相同，或更倾向于密集颗粒型亚型。无功能性生长激素细胞肿瘤的免疫反应性细胞比例较低，也意味着分化较低。大多数静默的生长激素细胞肿瘤共同表达泌乳素。根据WHO分类，稀疏颗粒型的生长激素细胞肿瘤被定义为侵袭性更强的肿瘤，这是基于一些研究，这些研究表明，与密集颗粒型亚型相比，稀疏颗粒状的生长激素肿瘤通常较大，更具侵袭性。在肢端肥大症患者中，稀疏颗粒型生长激素肿瘤对生长抑素类似物的反应较差，这可能是由于其生长抑素受体(SSTRs)表达较低所致。无功能/静默的泌乳素细胞垂体神经内分泌肿瘤是泌乳素（PRL）免疫反应性肿瘤，临床无高泌乳素血症征象，除了由于垂体柄效应所导致的泌乳素水平升高。除了转录因子Pit-1，它们还表达雌激素受体α。单纯的静默的泌乳素细胞肿瘤是罕见的。更多的情况下，在Pit-1阳性的肿瘤中泌乳素（PRL）与GH共同表达。静默性泌乳素细胞瘤在外科手术中非常罕见，但在尸检中却并不罕见。静默性和功能性的泌乳素细胞肿瘤均可分为稀疏颗粒型，表现为高尔基样泌乳素免疫反应或性（Golgi-like prolactin immunoreactivity ）；和致密颗粒型，肿瘤细胞呈弥漫性胞浆泌乳素表达。嗜酸干细胞腺瘤（Acidophil stem-cell adenoma ）仅以静默性的形式出现。功能性男性泌乳素瘤有更难治性的的行为，相比女性，似乎与ERα的低表达有关。然而,ERα的表达及与静默性泌乳素细胞肿瘤临床特点的相关性,仍然是模糊的。罕见的静默性泌乳素肿瘤的鉴别是重要的，因为添加多巴胺激动剂可能被考虑在治疗中，尽管其效果没有在临床功能想泌乳素瘤中得到很好的证明。无功能的/静默想性促甲状腺素肿瘤属于Pit-1谱系的肿瘤和β-TSH表达，但没有中枢性甲状腺机能亢进的临床和生化征象 。它们的发生率似乎略高于罕见的对应性的功能性的促甲状腺素肿瘤。静默性和功能性促甲状腺激素肿瘤从手术到复发的复发率和时间表现相似。无功能性促甲状腺激素肿瘤很少改变其内分泌活动而转化为功能性甲状腺激素垂体神经内分泌肿瘤。零细胞垂体神经内分泌肿瘤的定义是使用腺垂体激素和转录因子的抗体，缺乏向任何一种垂体前叶细胞分化的免疫组化证据。它们只占所有垂体肿瘤的百分比中极少一部分（nly a few percent of all pituitary tumors ）。然而，由于免疫组化方案不够理想和缺乏可靠的垂体特异性转录因子抗体，其发生率经常被高估。需要进一步的研究来阐明是否真的存在零细胞腺瘤，或者这类肿瘤仅仅反映了目前诊断方法的局限性。由于零细胞腺瘤是排除性诊断，因此有时与鞍区其他非腺垂体神经内分泌肿瘤的鉴别诊断存在困难。多激素低分化的Pit-1阳性肿瘤（Plurihormonal poorly differentiated Pit-1 positive tumors）(以前称为“静默性亚型3腺瘤（silent subtype 3 adenoma）”)是一种罕见的肿瘤，由大的多边形或梭形细胞组成，细胞核不典型，有时含有在常规HE染色或更容易在电子显微镜下观察到的被称为核球体（nuclear spheridia ）的内容物。它们可能在不同的或不一致的（variable and patchy）组合中表现为GH、PRL和TSH的免疫反应性的不同组合。尽管传统上被归为静默性，但在约30%的病例中，多激素Pit1阳性肿瘤与Pit1谱系激素分泌过度的临床征象有关。这种罕见类型的无功能性垂体神经内分泌肿瘤的正确诊断非常重要，因为它属于潜在难治性肿瘤，通常是大腺瘤，有海绵窦和斜坡受侵袭的倾向，并会复发。双重性/三重性垂体肿瘤（Double/triple pituitary tumors）是由来自不同细胞系的互相区分的成分（demarcated components ）组成的罕见肿瘤，可通过多种垂体特异性转录因子的表达来证实。在同一肿瘤中，可能存在静默的和分泌激素的成分。根据零星报道和小组系列研究报道，双重性/三重性垂体肿瘤在大多数病例中临床表现活跃。在尸检材料中越来越多地得到报道，存在两到三种无功能性垂体神经内分泌肿瘤联合在一起，这表明一些肿瘤在临床上是静默的。

图1，垂体转录因子在激素稀少或无激素-免疫标记的垂体神经内分泌肿瘤中的重要性:无功能性 -促性腺激素肿瘤，1a.苏木精伊红染色；1b.促性腺激素(FSH和LH)免疫标志物阴性；1c.SF-1核表达。无功能性促肾上腺皮质激素肿瘤，2a.苏木精伊红染色；2b.稀疏型ACTH表达；2c.T-Pit的核表达。无功能性-泌乳素肿瘤，3a.苏木素伊红染色;3b.稀疏型泌乳素表达；3c.Pit-1核表达(放大x400)无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）预后标志物无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）分级的一般预后标志物:有丝分裂计数、Ki-67指数、p53有丝分裂计数细胞增殖是神经内分泌肿瘤的重要预后标志物。有丝分裂计数在垂体神经内分泌肿瘤中的预后意义不可低估。强烈建议对整个手术标本的有丝分裂计数进行彻底的评估，尤其关注存在的Ki-67免疫反应热点区域。Ki-67增殖指数Ki-67的增殖评价必须采用单克隆MIB1抗体的免疫组化的方法。看上去Ki-67在分泌激素型和无分泌脑垂体肿瘤之间没有显著差异。方法学上的问题,解释困难,和在不同的研究中使用不同的临界值或许可以解释为什么解释Ki - 67最近得到新阐述,从先前垂体肿瘤的WHO分类的3%的临界值到2017年WHO分类的没有精确的Ki - 67阳性细胞核估计的临界值百分比。无功能性垂体神经内分泌肿瘤的研究表明Ki-67增殖指数仍然是预测复发的第二个参数，仅次于周围结构的侵袭性。卒中性无功能性垂体神经内分泌肿瘤（apoplectic PitNETs）的增殖性Ki-67指数和有丝分裂活性应谨慎评估，因为炎症细胞和坏死周围的细胞的增殖不应被解释为肿瘤细胞的增殖。在这种情况下，应尽可能在保存完好的肿瘤区域进行增殖评估，并考虑使用带有淋巴细胞标志物的免疫标记来评估Ki-67反应细胞中炎症细胞的比例。肿瘤抑制基因p53作为垂体神经内分泌肿瘤增殖的标志物即使很少在散发的垂体神经内分泌肿瘤中发现p53的突变,其核积累检测到免疫组织化学在先前的研究的垂体肿瘤中显示潜在的难治性行为,导致在以前的WHO分类中“非典型腺瘤”分类的标准中包括p53。然而，对于其在垂体肿瘤(包括无功能性肿瘤)中的解释仍未达成明确共识。考虑到上述增殖标志物均未被证明具有独立的预后，因此，尤其是在与侵袭性肿瘤生长相关的情况下，它们联合在一起被证实具有预测垂体神经内分泌肿瘤作用。其他垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）潜在的预后标记:雌激素受体亚型α（ERα）,钙粘蛋白（E-cadherin）,甲基转移酶MGMT垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）的雌激素受体亚型α（ERα）与侵袭性之间的相关性已在之前被研究报道。最近,缺乏雌激素受体亚型α（ERα）被发现与男性无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）患者术后放疗率或再次手术率有关。上皮分化标志物钙粘蛋白（E-cadherin）在无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）侵袭性中的作用尚不清楚，尽管早期的一项研究无法证明钙粘蛋白（E-cadherin）表达与无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）海绵窦侵袭的相关性。O -6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)的预后价值仍存在争议。在最近的一项荟萃分析中，无论肿瘤的功能状态如何，较低的甲基转移酶(MGMT)免疫组化表达均与无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）的复发性相关。这些新增加的预后标志物可能在常规实践中找到它们的位置并最终在无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）的分类中找到它们的位置之前，需要进行更多的研究。无功能性神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）的具体预后类别WHO的分类确认临床表现出更强难治性的五类垂体腺瘤，无论其组织学分级如何:稀疏颗粒型生长激素腺瘤、男性泌乳素型大腺瘤、Crooke细胞腺瘤、静默性促肾上腺皮质激素腺瘤和多激素的Pit-1阳性腺瘤。其中一种是静默的促肾上腺皮质激素肿瘤，表现为临床无功能性的，其他两种是多激素的Pit1谱系肿瘤和稀疏颗粒型促肾上腺皮质激素肿瘤，可能是临床上静默性的。无功能的垂体癌转移性垂体神经内分泌肿瘤或垂体癌是异常罕见的（exceptional），其中大多数是激素分泌。然而，偶有促性腺激素型，促肾上腺皮质激素型，或零细胞型无功能性垂体癌的报道。无功能性垂体癌也可能诊断不足，因为它们的转移瘤可以保持多年无症状。潜在预测标志物(生长抑素受体、多巴胺受体、甲基转移酶MGMT、MSH)由于到目前为止还没有针对无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）患者的药物治疗，因此迫切需要识别可能预测已建立或新疗法疗效的标志物。生长抑素受体（SSTRs），尤其是3型以及程度较少的（lesser degree）2型和5型，在促性腺激素肿瘤中表达，因此可能是无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）难治性患者多受体生长抑素类似物如帕瑞肽（pasireotide）的潜在靶点。多巴胺受体已在无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）的mRNA水平上得到证实。在最近的一项研究中，无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）患者在术后接受多巴胺激动剂以阻止肿瘤生长的治疗后，多巴胺受体2型（DR2）蛋白与mRNA表达和治疗反应之间没有相关性。遗憾的是，由于与抗多巴胺受体抗体（anti-DR-antibodies）相关的方法学困难，对多巴胺受体（DRs）的免疫组化研究很少。免疫组化评估的甲基转移酶（MGMT）表达降低，在一项对24例难治性垂体神经内分泌肿瘤和垂体癌患者的研究中发现，替莫唑胺（temozolomide）的效应较好，其中5例伴有难治性无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）。然而，将甲基转移酶（MGMT）作为垂体肿瘤中替莫唑胺作用的预测因子的结果仍然是矛盾的。DNA失配蛋白MSH6在无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）中的表达被认为是垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）中替莫唑胺作用的预测因子；然而，其他研究并未证实。无功能性垂体神经内分泌肿瘤（NF-PitNETs）组织病理学诊断方法的局限性免疫组织化学在垂体肿瘤的分类中起着至关重要的作用。由于其在组织切片蛋白检测中具有较高的灵敏度和特异性，且检测速度快，成本较低，且可实现自动化，是一种应用广泛的病理方法。同时，不同的前分析条件，如缺血时间和固定周期（ischemic time and duration of fixation），即使在标准化的临床实验室背景下也难以控制。免疫组化方案需要通过内部和外部（internal and external ）验证进行持续优化；免疫组化结果的读出（read-out）依赖于人，容易产生主观性解释（prone to subjective interpretation） 。在垂体肿瘤病理的背景下，分析前因素可能影响腺垂体激素的表达。联合应用腺垂体激素抗体和转录因子，至少在激素表达稀少的肿瘤中，可以提高垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）表型的准确性。然而，由于T-Pit抗体是最近才出现的，所以在常规的应用中，它的经验是有限的，即使是在垂体病理学专业的实验室中，最常用的抗SF-1抗体，克隆N1665，产生的结果也是不一致的。当涉及增殖标志物Ki-67时，由于量化方法的分歧和缺乏评估建议是新出现的问题。Ki-67在临床应用中的数字化量化经验有限，但应被视为减少评估中观察者内部和观察者之间差异的工具。结论无功能性垂体瘤是一组不同类型的垂体内分泌肿瘤，其精确的组织病理学分类依赖于腺垂体激素表达的详细免疫组化评价。评估有丝分裂计数、增殖Ki-67指数和肿瘤侵袭性对鉴别潜在难治性肿瘤非常重要。垂体特异性转录因子的应用在低分化肿瘤类型的识别中起着重要作用，其中一些可能表现为难治性行为。特别是在考虑药物治疗时，预测标志物应包括在分类中。还需要进一步的研究来识别临床无功能性垂体内分泌肿瘤中的其他预后和预测标志物。