Boc法固相合成多肽(含十肽合成解析)

当前比较常用的多肽合成方法是 Fmoc固相多肽合成方法,采用Fmoc基团保护氨基酸的氨基,在哌啶条件下脱去Fmoc。

基于Boc保护的多肽合成方法,常见于液相多肽合成方法中,今天介绍一种Boc保护的固相多肽合成方法


Boc固相法:经典的Merifield固相法

在Boc固相法中,氨基保护采用三氯乙酰(TFA)可脱去Boc,侧链保护基采用苄基醇类。常用的树脂为氯甲基化聚苯乙烯树脂或羟甲基化聚苯乙烯树脂,以及更稳定的对乙酰基苄酯(PMA)树脂。Boc保护a-氨基的氨基酸衍生物共价交联到树脂上,用三氟乙酸(TFA)脱除Boc,三乙胺和游离的氨基末端,然后再偶联下一个氨基酸。最终脱保护基多采用HF法。合成反应完成后,去除保护基,将肽链与树脂分离,即得目标产物。


特点:不必纯化中间产物,合成过程可以连续进行

基本过程:将目标多肽的C端羧基以共价键形式与一个不溶性高分子树脂相连,然后以这个氨基酸的氨基作为起点,与另一个氨基酸作业(用DDC做耦合剂)形成肽键,不断重复此过程,即可得产物。

溶剂:在固相合成中,绝大部分都采用二氯甲烷(DCM)作为溶剂,具有消旋率小和N-酰基脲形成慢的优点。


氨基、羧基、侧链的保护及脱除:

要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽,需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护,同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护,反应完成后再将保护基因除去。同液相合成一样,固相合成中多采用烷氧羰基类型作为α氨基的保护基,因为这样不易发生消旋。保护基的选择既要保证侧链基团不参与形成酰胺的反应,又要保证在肽合成过程中不受破坏,同时又要保证在最后肽链裂解时能被除去。

例如:最早是用苄氧羰基,由于它需要较强的酸解条件才能脱除,所以后来改为叔丁氧羰基(BOC)保护,用TFA(三氟乙酸)脱保护,但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的肽类的合成。羧基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法,可通过皂化除去或转变为肼以便用于片断组合;叔丁酯在酸性条件下除去;苄酯常用催化氢化除去。对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说,为了避免由于侧链功能团所带来的副反应,一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来

成肽反应

固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致,将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键,要形成酰胺键,经常用的手段是将羧基活化,变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的失去剂(如碳二亚氨)形成对称酸酐等方法来形成酰胺键。其中选用DCC、HOBT或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法接肽应用最广。

1、活化过程:

2、保护过程:

3、去除保护基过程:

十肽合成步骤

步骤一:

步骤二:

步骤三:(重复步骤一或步骤二),最终得到10肽。

缺点&优点

缺点:固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离,这样造成最终产物的纯度不如液相合成物,必需通过可靠的分离手段纯化。

优点:简化并加速了多步骤的合成;因反应在一简单反应器皿中便可进行,可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失;固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态,可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化,避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤,可避免中间体分离纯化时大量的损失;使用过量反应物,迫使个别反应完全,以便最终产物得到高产率;增加溶剂化,减少中间的产物聚焦;固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混,彼此产生一种相互的溶剂效应,这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。

固相合成的研究发展前景

固相多肽合成已经有40年的历史了,然而到现在,人们还只能合成一些较短的肽链,更谈不上随心所欲地合成蛋白质了,同时合成中的试剂毒性,昂贵费用,副产物等一直都是令人头痛的问题,而在生物体内,核糖体上合成肽链的速度和产率都是惊人的,那么,是否能从生物体合成蛋白质的原理上得到一些启发,应用在固相多肽合成(树脂)上,这是一个令人感兴趣的问题,也许是今后多肽合成的发展。

定制多肽合成

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